柿葉中單寧的提取工藝

林 蓂，楊 姍，吳靜瀾，2，3，張?zhí)焐?，張高紅

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省中藥民族藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；4.貴州康琦藥械有限公司，貴州 惠水 550600）

柿葉為柿樹(shù)科（Ebenaceae）柿樹(shù)屬（Diospyros L.）植物柿（Diospyros kaki）的新鮮或干燥葉子，主要含有有機(jī)酸、黃酮、三萜及多酚等有效化學(xué)成分[1]，其中，多酚類(lèi)成分主要為單寧。有試驗(yàn)證明，多酚類(lèi)物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化作用以及清除自由基的能力[2-3]，在護(hù)膚品中有抗氧化、抗衰老、抗紫外線(xiàn)、增白等多種作用[4]，所以柿葉提取物常作為美容護(hù)膚的原料。但目前關(guān)于柿葉中單寧提取方法的研究較少，且單寧的提取率不高[5]。為了提高柿葉中單寧的提取率，本研究以水為溶劑對(duì)柿葉中的單寧進(jìn)行提取工藝研究，并通過(guò)正交試驗(yàn)法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UⅤ-5900，上海元析儀器有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)）、恒溫水浴鍋、電子天平等。

1.2 試藥

柿葉經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定教研室丁寧老師鑒定為正品。沒(méi)食子酸對(duì)照品（110831-201605，中國(guó)食品藥品檢定研究院），鎢酸鈉、鉬酸鈉、磷酸、鹽酸、硫酸鋰、無(wú)水碳酸鈉等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 柿葉中單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

2.1.1 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液的配制

于250.0 mL圓底燒瓶中加入鎢酸鈉8 g、鉬酸鈉2 g、蒸餾水56.0 mL、磷酸4.0 mL及鹽酸8.0 mL，充分混勻，文火加熱回流2.0 h后，去冷凝管，加入硫酸鋰4 g、蒸餾水4.0 mL，混勻，定容于100.0 mL棕色容量瓶中[6]。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精確稱(chēng)取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品2.53 mg，加入蒸餾水定容于100.0mL棕色容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.025 3 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

精確吸取1.0、1.2、2.0、3.0、4.0、5.0 mL沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，分別加入1.5 mL鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液、10.0 mL蒸餾水，用70 g/L Na2CO3定容于25.0 mL棕色容量瓶中，30 ℃顯色1.5 h后，在765 nm下測(cè)得溶液吸光度[7]。以沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（見(jiàn)圖1）：y=116.19x+0.025 4，r=0.999 9，R2=0.999 8。

圖1 沒(méi)食子酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.1.4 柿葉中單寧的提取及測(cè)定方法

稱(chēng)取適量柿葉，加入一定比例的蒸餾水，置于恒溫水浴鍋中加熱回流，過(guò)濾得到濾液，定容后取待測(cè)樣品溶液 1.0 mL，與對(duì)照品同法測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算單寧的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同種類(lèi)柿葉中單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較

分別取新鮮柿葉、干燥新鮮柿葉與干燥落柿葉各1 g，以水為提取溶劑，料液比為1∶30，在100 ℃條件下提取1次，提取時(shí)間為1.0 h，測(cè)得單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)（見(jiàn)圖2）。

圖2 不同種類(lèi)柿葉中單寧的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由圖2可知，干燥新鮮柿葉中單寧的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于新鮮柿葉和干燥落柿葉，因此，選用干燥新鮮柿葉進(jìn)行后續(xù)工藝優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.2 提取時(shí)間的考察

取干燥新鮮柿葉1 g，以水為提取溶劑，料液比為1∶30，在60 ℃條件下提取1次，以提取時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h時(shí)測(cè)得的單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)（見(jiàn)圖3）。

圖3 提取時(shí)間對(duì)柿葉單寧提取率的影響

由圖3可知，適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間可提高單寧的提取率，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，單寧提取率的提升逐漸平緩，因此，應(yīng)選擇合適的提取時(shí)間進(jìn)行提取以提高效率。

2.2.3 提取溫度的考察

取干燥新鮮柿葉1 g，以水為提取溶劑，料液比為1∶30，提取時(shí)間為1.0 h，提取1次，以提取溫度分別為室溫29、40、60、80、100 ℃時(shí)測(cè)得的單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)（見(jiàn)圖4）。

圖4 提取溫度對(duì)柿葉單寧提取率的影響

由圖4可知，溫度對(duì)單寧提取率的影響較大，較高的溫度對(duì)單寧的提取有利。但由于單寧的化學(xué)性質(zhì)較為活潑，在高溫下易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因此，應(yīng)在適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行提取。

2.2.4 料液比的考察

取干燥新鮮柿葉1 g，以水為提取溶劑，在60 ℃條件下提取1.0 h，提取1次，以料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50時(shí)測(cè)得的單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)（見(jiàn)圖5）。

圖5 料液比對(duì)柿葉單寧提取率的影響

由圖5可知，隨著浸提液的增加，單寧的提取率先提升后趨于平穩(wěn)，在一定料液比下，大部分有效成分被完全提取，因此，應(yīng)選取合適的料液比以免造成浪費(fèi)。

2.2.5 提取次數(shù)的考察

取干燥新鮮柿葉1 g，以水為提取溶劑，料液比為1∶30，在60 ℃條件下提取1、2、3、4、5次，測(cè)得單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)（見(jiàn)圖6）。

由圖6可知，并非提取的次數(shù)越多越好，提取3次之后，單寧提取率的提升幅度減小，說(shuō)明大部分單寧已被提取，因此，從效率方面考慮，應(yīng)提取3次。

圖6 提取次數(shù)對(duì)柿葉單寧提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定單寧提取率的影響因素主要為提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、料液比（C），建立因素水平表L9（34）（見(jiàn)表1），以單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)和出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表1 因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合正交試驗(yàn)的分析結(jié)果以及單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，柿葉單寧提取率影響因素的主次順序?yàn)榱弦罕?、提取溫度、提取時(shí)間，柿葉單寧的最優(yōu)提取工藝：在100 ℃下提取1.0 h，料液比為1∶30，提取次數(shù)為3次。

2.4 驗(yàn)證性試驗(yàn)

在最優(yōu)提取條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，單寧平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到27.43 mg/g，出膏率為16.57%，證明了結(jié)果的可靠性。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度

精確吸取質(zhì)量濃度為0.025 3 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 1.0 mL，按2.1.3的方法操作，在765 nm下連續(xù)測(cè)定6次吸光度，結(jié)果依次為0.374、0.374、0.374、0.374、0.375、0.375，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.14%，表明該儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性

在100 ℃條件下，以1∶30的料液比提取1 g干燥落柿葉 1.0 h，平行提取6次，按2.1.3的方法操作，在765 nm下測(cè)定，計(jì)算單寧的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.31 mg/g，RSD為1.90%。

2.5.3 穩(wěn)定性

取干燥落柿葉的提取液1.0 mL（制備方法見(jiàn)2.1.4），室溫下分別放置0、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 h后，按2.1.3的方法操作，在765 nm下測(cè)定吸光度，結(jié)果依次為0.633、0.633、0.635、0.635、0.636、0.638，RSD為0.30%，表明提取液在 6.0 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.5.4 加樣回收率

精確吸取已知質(zhì)量濃度的提取液，隨后加入沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，按2.1.3的方法操作測(cè)定吸光度，按公式“加樣回收率=（測(cè)得量-原質(zhì)量）/加樣量×100%”計(jì)算加樣回收率，結(jié)果如表3所示。由表3可知，加樣回收率均在95.00%～105.00%，可見(jiàn)該方法的系統(tǒng)誤差較小。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

柿葉中的單寧具有抗氧化、抗衰老等作用，常被用于美容制品中，柿葉中單寧的提取率直接影響美容制劑的使用效果。本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)探討了柿葉單寧的提取工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柿葉單寧提取率的影響因素主次順序?yàn)榱弦罕?、提取溫度、提取時(shí)間。其中，提取時(shí)間并非越長(zhǎng)越好，在長(zhǎng)時(shí)間的高溫下進(jìn)行提取，柿葉中的單寧成分會(huì)發(fā)生一些不可逆的化學(xué)反應(yīng)，例如氧化、降解等?；谶@一點(diǎn)，可以通過(guò)增加提取次數(shù)來(lái)提高單寧的提取率。

在對(duì)單寧質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，顯色時(shí)間以及顯色溫度對(duì)最后結(jié)果的影響較大，因此，要嚴(yán)格控制顯色條件，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

在本試驗(yàn)的最優(yōu)提取條件下，單寧平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到27.43 mg/g，出膏率為16.57%，高于其他多數(shù)研究中的單寧提取率[5-8]。

綜上所述，本試驗(yàn)的提取方法操作簡(jiǎn)單便利、提取率高，有利于將來(lái)對(duì)柿葉單寧的研究以及開(kāi)發(fā)利用。