根瘤農(nóng)桿菌T-DNA插入介導(dǎo)的煙曲霉耐藥突變菌的分子機(jī)制

龍南彪

(邵陽學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 邵陽， 422000)

煙曲霉是一種分布廣泛的條件致病真菌，在免疫缺陷的個(gè)體中，由煙曲霉導(dǎo)致的肺部感染具有較高的病死率[1]。近年來，雖然醫(yī)療技術(shù)發(fā)展迅猛，但免疫缺陷的人數(shù)卻逐年增多，煙曲霉發(fā)病率也呈上升之勢(shì)[2]。與細(xì)菌不同，煙曲霉致病機(jī)制主要與其占位生長(zhǎng)相關(guān)。影響煙曲霉生長(zhǎng)的因素諸多[3]，主要有：(1)食物獲取。包括碳源、氮源、無機(jī)鹽(鐵、鈣、鋅、銅以及磷酸鹽等)。(2)宿主環(huán)境。如低氧、pH變化、氧化應(yīng)激、熱刺激等。(3)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。如黑色素(melanin)、葡聚糖、疏水蛋白、GAG(galactosaminogalactan)等。(4)其他因素。如生物膜及混合感染等。

目前，治療曲霉病的藥物主要有兩類。一類是唑類藥物，其機(jī)制是阻斷細(xì)胞膜的主要成分——麥角固醇的生物合成；另一類是阻斷β-1,3 glucan合成[4]。有數(shù)據(jù)顯示，臨床分離的煙曲霉菌株中3.2%具有單重或多重耐藥[3]。煙曲霉對(duì)唑類藥物耐受的機(jī)制主要與其藥物靶點(diǎn)Cyp51A位點(diǎn)突變以及啟動(dòng)子區(qū)插入突變有關(guān)[5-6]。相關(guān)研究顯示，煙曲霉對(duì)唑類藥物的耐藥性可能與線粒體功能紊亂以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生密切相關(guān)[7]。

通過用根瘤農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)的插入突變構(gòu)建了一個(gè)含1 805株煙曲霉的突變體庫,并從中篩選到16株唑類藥物耐藥突變株[8]。本研究挑取了第7號(hào)突變株(M7)進(jìn)行了T-DNA插入位點(diǎn)鑒定、相關(guān)基因敲除以及耐藥表型試驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，M7耐藥表型并不是因?yàn)槠洳迦胛稽c(diǎn)相關(guān)基因Afu5g08910突變引起，而是由Cyp51A在第54位Gly錯(cuò)義突變所致。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株：煙曲霉菌株Δcyp51A由南京師范大學(xué)張弛博士饋贈(zèng)；ΔM7以及Δcyp51AGly54Arg為本研究構(gòu)建；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

主要試劑：高保真酶Phanta Max Super-Fidelity和重組克隆試劑盒One Step Cloning Kit C115購(gòu)自Vazyme公司；普通Easy-taq DNA聚合酶和連接載體pBluntzero購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、引物DNA以及潮霉素(hygromycin B)購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；SpeI內(nèi)切酶購(gòu)自Taraka公司。

1.2 煙曲霉的培養(yǎng)及耐藥性分析

煙曲霉的培養(yǎng)使用YAG/YUU培養(yǎng)基，具體配置方法參照文獻(xiàn)[9]。為檢測(cè)煙曲霉的耐藥性，在YAG培養(yǎng)基中添加了不同濃度的伊曲康唑(ITZ)。煙曲霉培養(yǎng)溫度為37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為2～3 d。

1.3 煙曲霉農(nóng)桿菌插入突變株基因組重測(cè)序

首先，用YAG液體培養(yǎng)基培養(yǎng)待測(cè)煙曲霉菌株20 h，然后,用無菌紗布將培養(yǎng)基濾干，立刻置于液氮中速凍。所有菌株的DNA提取、建庫、測(cè)序及分析均由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。流程如下：提取煙曲霉基因組DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，合格后再隨機(jī)打斷成350～500 bp的片段，經(jīng)過片段末端修復(fù)、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成建庫，然后，經(jīng)Illumina測(cè)序后進(jìn)一步進(jìn)行T-DNA插入位點(diǎn)分析及SNP位點(diǎn)鑒定。

1.4 煙曲霉基因敲除與回補(bǔ)

主要利用同源重組法進(jìn)行基因敲除[10]。首先,用引物M7 P1/P3和M7 P4/P6分別擴(kuò)增M7基因(Afu5g08910)左右同源臂，pyr4 F/R擴(kuò)增篩選Marker pyr4。然后,用引物M7 P2/P5，以左右同源臂和篩選Marker pyr4做模板，經(jīng)融合PCR擴(kuò)增即可將3個(gè)片段融為一體作為敲除載體。再將其與克隆載體pBlunt zero連接，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取陽性克隆即可。對(duì)于Cyp51A位點(diǎn)突變載體的構(gòu)建，首先,用Cyp51A F/R將Cyp51A基因(包括啟動(dòng)子區(qū)、ORF及UTR區(qū))擴(kuò)增。然后,將其重組到p-zero-hph載體(篩選Marker是潮霉素)的Spe I位點(diǎn)。對(duì)于M7基因敲除，使用的背景菌株為A1160，Cyp51A位點(diǎn)突變回補(bǔ)則在Cyp51A背景上進(jìn)行。敲除突變菌用診斷引物M7 S1/S2進(jìn)行驗(yàn)證，確保目的基因完全被敲除。對(duì)于使用潮霉素作為篩選Marker的菌株，培養(yǎng)基中需添加200 μg/mL的潮霉素。使用的所有引物見表1。

表1 引物列表

1.5 煙曲霉基因組提取

用無菌牙簽刮取少量菌絲體至500 μL Lysis buffer中，60 ℃加熱30 min，然后加入150 μL醋酸鉀溶液震蕩30 s，12 000 g離心10 min，吸取上清液至無菌的1.5 mL的離心管中，加入等體積異丙醇渦旋混勻，12 000 g離心3 min，去上清，加400 μL 70%乙醇洗滌沉淀，12 000 g 離心1 min，去上清，干燥DNA后加適量去離子水溶解DNA。提取的DNA可以直接用于診斷PCR或者DNA片段回收擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)的插入突變菌鑒定

從圖1(A)可以看出，相較背景菌株Af293而言，M7展示出很明顯的耐藥性。為深入研究M7耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制，對(duì)其基因組進(jìn)行了重測(cè)序。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根瘤農(nóng)桿菌T-DNA插入的位置位于Afu5g08910基因內(nèi)部見圖1(B)。為驗(yàn)證基因組重測(cè)序是否準(zhǔn)確，在Afu5g08910基因兩側(cè)設(shè)計(jì)了一對(duì)診斷引物，通過診斷PCR發(fā)現(xiàn)，Af293中Afu5g08910基因以及內(nèi)參基因擴(kuò)增大小均正確，而M7只有內(nèi)參基因擴(kuò)增出了條帶，說明Afu5g08910基因中插入了一個(gè)較大的DNA片段見圖1(C)。綜上所述，通過基因組重測(cè)序,本研究成功鑒定了M7中農(nóng)桿菌T-DNA插入位置位于Afu5g08910基因中。

(A) 煙曲霉突變株M7耐藥表型分析;(B) M7突變株中T-DNA插入位點(diǎn)分析；(C)M7突變株中T-DNA插入位點(diǎn)驗(yàn)證

2.2 敲除菌耐藥性分析

對(duì)煙曲霉A1160進(jìn)行敲除，命名為ΔM7。如圖2(A)所示，診斷PCR顯示ΔM7中左右同源臂均發(fā)生了同源重組。野生型菌株(WT)中Afu5g08910有明顯的擴(kuò)增條帶，且大小正確，而ΔM7中未見有擴(kuò)增條帶，說明Afu5g08910被完全敲除了。進(jìn)一步，在含有伊曲康唑的平板上對(duì)ΔM7的耐藥性進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn),ΔM7和WT的耐藥性程度無明顯差別，見圖2(B)，說明農(nóng)桿菌T-DNA插入突變株M7耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制可能與Afu5g08910的突變無關(guān)。

圖2 ΔM7敲除菌驗(yàn)證(A)和耐藥性分析(B)

2.3 農(nóng)桿菌T-DNA插入突變株SNP分析

上述基因組重測(cè)序以及診斷PCR均證明農(nóng)桿菌T-DNA插入位點(diǎn)位于Afu5g08910內(nèi)，但其敲除卻未表現(xiàn)出耐藥性。SNP位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，M7中cyp51A第160位堿基由G突變成了C，見圖3(A)，導(dǎo)致Cyp51A第54位氨基酸由Gly突變成了Arg，見圖3(B)。Cyp51A是唑類藥物的作用靶點(diǎn)，其突變可以導(dǎo)致其與唑類藥物的結(jié)合能力下降，從而導(dǎo)致耐藥性。圖3(C)顯示，當(dāng)敲除cyp51A時(shí)，相較于WT，Δcyp51A對(duì)唑類藥物ITZ的敏感性顯著提高，而在Δcyp51A中轉(zhuǎn)入Gly54Arg突變的Cyp51A時(shí)，Δcyp51AGly54Arg相比于WT而言對(duì)ITZ的耐藥性明顯增強(qiáng)，說明Cyp51A的Gly54Arg突變可導(dǎo)致煙曲霉耐藥性產(chǎn)生。因此，M7之所以表現(xiàn)出唑類藥物耐受，可能與Cyp51A的Gly54Arg的突變有關(guān)。

(A)和(B) M7中cyp51A的SNP位點(diǎn)鑒定以及模式圖;(C) Δcyp51A突變回補(bǔ)菌耐藥性分析

3 討論

目前臨床上治療侵襲性曲霉病的一線藥物是唑類藥物[11]，其主要通過結(jié)合麥角固醇合成的關(guān)鍵酶Cyp51A抑制曲霉活性從而達(dá)到抑制其生長(zhǎng)的目的[12]。然而，Cyp51A的突變嚴(yán)重削弱了唑類藥物的治療效果[13]。Cyp51A突變頻率較高的位點(diǎn)主要集中在ORF區(qū)的G54,G138,M220和G448以及啟動(dòng)子區(qū)串聯(lián)序列的插入(TR34/L98H,51TR46/Y121F/T289A和TR53)[5]。目前認(rèn)為，導(dǎo)致真菌耐藥性產(chǎn)生的原因主要有2個(gè)：(1)農(nóng)業(yè)上廣譜抗真菌農(nóng)藥的應(yīng)用，使土壤中對(duì)藥物敏感的菌株被殺滅，而存留下來的均具有一定的耐藥性，這些耐藥性菌株可進(jìn)一步感染人體；(2)臨床上抗真菌藥物的應(yīng)用使敏感菌株被殺滅，而具有耐藥突變的菌株則可繼續(xù)存活，導(dǎo)致治療效果不佳[14]。

本研究中，發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌T-DNA插入突變株M7(Afu5g08910)耐藥性的產(chǎn)生并不是因?yàn)锳fu5g08910插入突變產(chǎn)生，而是由于M7中Cyp51A第54位Gly突變所致。本研究前期構(gòu)建的煙曲霉突變體庫只有1 805株而耐藥性菌株卻達(dá)到了16株，這16株耐藥突變菌一部分并不是T-DNA插入導(dǎo)致相關(guān)基因失活所致，而是某些位點(diǎn)突變所致。本研究后續(xù)對(duì)其中8株基因組重測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，有2株(包括M7)在Cyp51A編碼區(qū)發(fā)生了突變，其他菌株在其他位點(diǎn)也存在部分位點(diǎn)突變，但尚未進(jìn)一步驗(yàn)證。對(duì)于這些T-DNA插入突變株中位點(diǎn)突變產(chǎn)生的機(jī)制，可能與煙曲霉自身基因突變有關(guān)，實(shí)驗(yàn)過程用唑類藥物進(jìn)行篩選實(shí)際上起到了一個(gè)選擇的目的。事實(shí)上，除了唑類藥物壓力外，若施加其他的壓力也會(huì)起到類似的篩選作用，如以前實(shí)驗(yàn)室通過農(nóng)桿菌T-DNA插入突變庫篩選低鐵敏感突變株，T-DNA插入位點(diǎn)經(jīng)tail-PCR以及基因組重測(cè)序雙重驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)目的基因的敲除并沒有表現(xiàn)出低鐵敏感的現(xiàn)象，現(xiàn)在之所以出現(xiàn)這種情況，可能是某個(gè)對(duì)低鐵敏感的基因位點(diǎn)突變所致，當(dāng)然，這需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究為以后突變體庫篩選過程中遇到的插入突變基因與目的表型不一致的現(xiàn)象提供了參考。