補(bǔ)骨脂種子提取物對蘋果腐爛病菌的抑菌活性研究

安 瀾，關(guān)麗杰

(沈陽化工大學(xué)，沈陽，110142)

蘋果是世界上最重要的商品化栽培和適應(yīng)性強(qiáng)的溫帶果樹之一[1]。我國是世界第一大蘋果生產(chǎn)國，產(chǎn)量約占全球50%。蘋果樹在生長發(fā)育階段會受到真菌、細(xì)菌、病毒等病害的威脅[2]。蘋果腐爛病ValsamaliMiyabe et Yamada.又稱爛皮病，是蘋果樹上最嚴(yán)重的病害之一[3]，病菌除危害樹干外，也能侵染果實[4]，是限制我國蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，嚴(yán)重時可導(dǎo)致死樹和毀園[5]?；瘜W(xué)藥物防治是防治蘋果腐爛病的主要手段[6]，常用的藥劑有丁香菌酯、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑等[7-9]。其中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑20%丁香菌酯懸浮劑對蘋果腐爛病菌有較高的離體抑制活性，在田間采用刮疤處理再進(jìn)行藥劑涂抹能有效地抑制蘋果腐爛病病疤的復(fù)發(fā)，對病疤的愈合有較好的促進(jìn)效果[10]；三唑類殺菌劑戊唑醇能抑制蘋果腐爛病菌菌體麥角甾醇的生物合成而影響菌絲生長、孢子萌發(fā)和病斑的擴(kuò)展[11]；苯醚甲環(huán)唑同為三唑類殺菌劑[12]，對蘋果腐爛病菌雖有較好的抑菌作用，但田間防效不如戊唑醇，其原因可能是由于該藥劑作用位點單一，長期反復(fù)使用會引起病菌產(chǎn)生抗藥性[13]。補(bǔ)骨脂種子提取物是一種植物源殺菌劑，苯丙烯菌酮是其主要活性成分之一[14]，其對水稻稻瘟病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜炭疽病菌等11種植物病原菌有較好的抑制活性[15]，0.2%苯丙烯菌酮微乳劑在田間對水稻稻瘟病和水稻紋枯病也有很好的治療效果[16-17]。本研究采用菌絲生長抑制率和孢子萌發(fā)抑制率法測定補(bǔ)骨脂種子提取物對蘋果腐爛病菌的抑制活性并通過田間試驗驗證，為其在田間示范推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

供試菌種為沈陽化工大學(xué)生物工程教研室保存的蘋果腐爛病ValsamaliMiyabe et Yamada.病菌。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 試驗儀器 試驗所用儀器主要有SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn))、SW-CJ-IG 單人凈化工作臺(蘇州凈化儀器有限公司生產(chǎn))、LDZX-40BI 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn))、SCOUT 電子天平SCA210(臾豪斯國際貿(mào)易有限公司生產(chǎn))、TSQ-280振蕩培養(yǎng)箱(上海精宏試驗設(shè)備有限公司生產(chǎn))、CX33生物顯微鏡(山東省濟(jì)南市歷城區(qū)濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))、迷霧氣候箱、精確噴霧器等。

1.2.2 供試藥劑 補(bǔ)骨脂種子提取物(含2%苯丙烯菌酮，沈陽同祥生物農(nóng)藥有限公司生產(chǎn))；補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑(含0.2%苯丙烯菌酮，沈陽同祥生物農(nóng)藥有限公司生產(chǎn))；20%丁香菌酯懸浮劑(吉林省八達(dá)農(nóng)藥有限公司生產(chǎn))。

1.3 病菌抑制活性試驗

1.3.1 對病菌菌絲生長的抑制作用 采用菌絲生長速率法。用丙酮將補(bǔ)骨脂種子提取物完全溶解后加入到PDA培養(yǎng)基中，制成終濃度為3.3、10、30、90、270 mg/L含藥培養(yǎng)基。以等體積的丙酮加入到培養(yǎng)基中作為對照。取預(yù)先培養(yǎng)好的蘋果腐爛病菌平板上的菌餅(直徑為6 mm)，移入含有不同濃度藥劑的平板和對照平板中央，每處理5個重復(fù)，置27 ℃下培養(yǎng)5 d，測量菌落直徑并計算抑制率，采用最小二乘法計算毒力回歸方程和有效抑制中濃度(EC50值)。

1.3.2 病菌孢子萌發(fā)的抑制活性 從長勢良好的蘋果腐爛病菌平板上切取直徑為6 mm的菌餅移植于PDA平板中央，置于27 ℃下培養(yǎng)30 d，待形成分生孢子器后向蘋果腐爛病菌平板中加2%無菌葡萄糖水5 mL，用毛刷沿一個方向刷洗蘋果腐爛病菌平板表面，對洗刷下來的分生孢子器進(jìn)行研磨釋放出孢子，經(jīng)4層紗布過濾，得到濃度為1×105～1×106個/mL的孢子懸液。

將補(bǔ)骨脂種子提取物配制成濃度為3.3、10、30、90、270 mg/L的丙酮溶液，然后分別取10 μL上述藥液和190 μL的孢子懸液至24微孔板，使得藥劑終濃度為0.165、0.5、1.5、4.5、13.5 mg/L，每處理3個重復(fù)，另設(shè)空白對照。將各處理置27 ℃恒溫下培養(yǎng)，每隔2 h鏡檢觀察孢子萌發(fā)的情況，蘋果腐爛病菌分生孢子為香腸形，但萌發(fā)時一般先膨大變形，以孢子是否膨大變形為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)對照組孢子萌發(fā)率達(dá)到90%時，每處理隨機(jī)選取200個孢子統(tǒng)計孢子萌發(fā)數(shù)目并計算萌發(fā)抑制率。

1.4 田間防效試驗

1.4.1 試驗地點及環(huán)境條件 試驗地位置在陜西省咸陽市乾縣薛錄鎮(zhèn)新豐村。試驗蘋果樹樹齡為20年，品種為富士，生長良好。試驗地為土婁土，呈中性，每667 m2施復(fù)合肥100 kg，澆水一次。無試驗地病蟲害發(fā)生情況及藥劑使用情況。

1.4.2 試驗設(shè)計和安排 供試藥劑處理見表1。

表1 供試藥劑試驗設(shè)計

1.4.3 小區(qū)安排 采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，單個小區(qū)共5株樹，當(dāng)年新生病疤8個以上，每處理重復(fù)4次。

1.4.4 施藥方法及時間 采用刮疤涂抹法，首先用刀刮凈腐爛病病斑及周緣少量健康組織切成梭條形茬，然后將藥劑按比例稀釋攪拌均勻，輕輕用毛刷將藥液均勻涂于皮茬切口處及周圍皮層。試驗于2019年4月7日涂抹病疤一次，共施藥一次。

1.4.5 調(diào)查方法 于2019 年4月7日施藥前進(jìn)行基數(shù)調(diào)查， 2020年4月1日發(fā)病盛期后進(jìn)行藥效調(diào)查，共調(diào)查2次。藥前調(diào)查病疤塊基數(shù)，藥后調(diào)查各小區(qū)全部試驗樹的新生病塊數(shù)和舊病疤的復(fù)發(fā)情況，統(tǒng)計各小區(qū)平均每株新病塊數(shù)和舊病疤復(fù)發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 對病菌菌絲生長的抑制活性

補(bǔ)骨脂種子提取物在濃度為3.3、10、30、90、270 mg/L時，采用菌絲生長速率法測定其對蘋果腐爛菌的抑制活性。試驗結(jié)果看出，當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物濃度為3.3、10、30、90、270 mg/L時，對蘋果腐爛病菌菌絲生長抑制率分別為33.43%、49.70%、85.20%、92.60%、96.15%。一定濃度范圍內(nèi)隨著處理濃度的增加對菌絲生長的抑制率逐漸增大，其EC50值為6.766 mg/L(見表2)。補(bǔ)骨脂種子提取物對蘋果腐爛病菌菌絲生長具有很強(qiáng)的抑制作用。

表2 不同濃度補(bǔ)骨脂種子提取物對蘋果腐爛病菌菌絲生長的抑制活性

2.2 對病菌孢子萌發(fā)的抑制活性

補(bǔ)骨脂種子提取物濃度為0.165、0.5、1.5、4.5、13.5 mg/L時，采用孢子萌發(fā)法，測定其對蘋果腐爛病菌孢子萌發(fā)的抑制作用。試驗結(jié)果看出，補(bǔ)骨脂種子提取物對蘋果腐爛病菌孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用。當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物的濃度為0.165、0.5、1.5、4.5、13.5 mg/L時，對蘋果腐爛病菌孢子萌發(fā)的抑制率分別為49.22%、71.93%、86.09%、93.04%、98.86%，說明隨著補(bǔ)骨脂種子提取物濃度的升高，對孢子萌發(fā)的抑制作用不斷增強(qiáng)。其EC50值為0.172 mg/L，說明補(bǔ)骨脂種子提取物在很低濃度下就對蘋果腐爛病菌孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用(見表3)。

表3 不同濃度補(bǔ)骨脂種子提取物對蘋果腐爛病孢子萌發(fā)的抑制活性

2.3 對蘋果腐爛病的田間防效

試驗結(jié)果看出，補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑200、400、600倍液及對照藥劑20%丁香菌酯懸浮劑200倍液處理，藥后第二年的新增病塊增長率分別為2.50%、6.49%、12.11%、6.49%；平均防效分別為81.25%、75.63%、71.32%、76.67%。從新增病塊增長率和平均防效來看，相同劑量的補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑均好于對照藥劑20%丁香菌酯懸浮劑。對第二年的防治效果進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表明，在0.05水平和0.01水平上，補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑 200倍液處理與對照藥劑20%丁香菌酯懸浮劑均有顯著差異。經(jīng)田間系統(tǒng)觀察得知，補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑在試驗劑量范圍內(nèi)對蘋果樹安全，無不良影響(見表4)。

表4 補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑防治蘋果腐爛病的田間試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

蘋果腐爛病是蘋果樹生長過程中較為嚴(yán)重的病害，影響蘋果樹正常生長發(fā)育，造成蘋果果實品質(zhì)下降，甚至停產(chǎn)絕收。目前防治蘋果腐爛病大多以化學(xué)農(nóng)藥為主。本研究采用菌絲生長抑制率和孢子萌發(fā)抑制率2種室內(nèi)生測方法研究了植物源殺菌劑補(bǔ)骨脂種子提取物對蘋果腐爛病菌的抑制活性，并通過田間試驗進(jìn)行驗證。

通過測定補(bǔ)骨脂種子提取物對蘋果腐爛病菌的抑菌活性，證明了其對蘋果腐爛病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有較強(qiáng)的抑制作用。試驗發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，補(bǔ)骨脂種子提取物的濃度與蘋果腐爛病菌菌絲生長及孢子萌發(fā)的抑制率呈正相關(guān)，即隨著濃度增大，抑制率也增大，EC50值分別為6.766、0.172 mg/L。田間防效試驗表明，補(bǔ)骨脂種子提取物微乳劑(含0.2%苯丙烯菌酮)對蘋果腐爛病有顯著防治效果，其200～600倍液進(jìn)行刮疤涂抹處理在第二年的防治效果達(dá)71%～81%，而且安全性好，可有效控制蘋果樹腐爛病的發(fā)生。同時，也可與其他不同作用機(jī)制的殺菌劑交替使用，以延緩病原菌抗藥性的產(chǎn)生。

由于蘋果腐爛病是潛伏侵染性病害，樹勢衰弱時就能誘發(fā)病疤復(fù)發(fā)[18]。因此，在做到合理的藥物防治的同時又要對果園進(jìn)行科學(xué)管理，增強(qiáng)樹體本身的抗病性，來滿足綠色果品生產(chǎn)的需要。