張議文 劉輝 馮成天 胡義鈺 王真輝 袁坤

摘? 要：氰丙氨酸合成酶（β-cyanoalanine synthase，β-CAS）是植物氰化物解毒的關(guān)鍵酶，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫中扮演重要角色。本研究從巴西橡膠樹中克隆氰丙氨酸合成酶基因HbCAS，并對(duì)其進(jìn)行分析。結(jié)果表明：HbCAS基因開放閱讀框長(zhǎng)為1113 bp，編碼370個(gè)氨基酸，其理論分子量為40.15 kDa，等電點(diǎn)為8.90，屬于色氨酸合成酶超家族。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，HbCAS基因在橡膠樹各種組織中均有表達(dá)，其中在膠乳中的表達(dá)量最高。同健康樹相比，HbCAS基因在死皮樹中的表達(dá)顯著下調(diào)。過氧化氫及乙烯利、茉莉酸甲酯、水楊酸及脫落酸等多種激素均能調(diào)控HbCAS基因的表達(dá)。同時(shí)，HbCAS基因的表達(dá)也受干旱、低溫、甲基紫精、高鹽等多種非生物脅迫調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果揭示HbCAS基因可能在橡膠樹死皮發(fā)生、活性氧信號(hào)、激素調(diào)節(jié)及多種非生物脅迫應(yīng)答中起重要作用。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹;氰丙氨酸合成酶;死皮;脅迫應(yīng)答

中圖分類號(hào)：S794.1????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Cloning and Expression Analysis of a β-cyanoalanine Synthase Gene HbCAS in Hevea brasiliensis

ZHANG Yiwen1， LIU Hui2， FENG Chengtian2， HU Yiyu2， WANG Zhenhui2， YUAN Kun2*

1. College of Tropical Crop， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： β-cyanoalanine synthase （β-CAS）， a key enzyme involved in cyanide detoxification in plants， plays an important role in regulating the growth and development and stress response. In this study， HbCAS was cloned from H. brasiliensis. The results indicated that HbCAS had an open reading frame （ORF） of 1113 bp， encoding 370 amino acids with a theoretical molecular weight 40.15 kDa and an isoelectric point of 8.90， belonging to the superfamily of tryptophan synthase beta. Quantitative real-time PCR analysis showed HbCAS was found to express in all tested tissues with the highest expression in latex. Compared with the healthy trees， HbCAS expression significantly decreased in the tapping panel dryness （TPD） infected trees. Hydrogen peroxide （H2O2） and various hormones of ethephon （ETH）， Methyl jasmonate （MeJA）， salicylic acid （SA） and abscisic acid （ABA） all regulated the expression of HbCAS. Meanwhile， HbCAS expression was regulated by diverse abiotic stresses of drought， low temperature， methyl viologen and high salt. These results suggest that HbCAS might play key roles in TPD onset， reactive oxygen species signaling， hormone regulating， as well as various abiotic stresses responses.

Keywords： Hevea brasiliensis; β-cyanoalanine synthase; tapping panel dryness; stress response

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.003

氰丙氨酸合成酶（β-cyanoalanine synthase，β-CAS）是植物降解氰化物的關(guān)鍵酶。生氰糖苷又稱為氰苷，是植物的次生代謝產(chǎn)物，含有生氰糖苷的植物為生氰植物。當(dāng)植物遭受外界脅迫時(shí)，生氰糖苷會(huì)與其降解酶接觸發(fā)生酶促水解反應(yīng)，釋放出有毒物質(zhì)氫氰酸（HCN）[1-3]。為了控制植物細(xì)胞內(nèi)氰化物的濃度，植物利用β-CAS進(jìn)行解毒。β-CAS以HCN和半胱氨酸為底物催化合成β-氰丙氨酸，氰丙氨酸進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為天冬酰胺[3]。

β-CAS廣泛存在于植物中。在擬南芥中有3個(gè)編碼β-CAS的基因，分別為CYS-C1、CYS-D1和CYS-D2[4]，在煙草中有2個(gè)編碼β-CAS的基因[5-6]。已有研究表明，β-CAS參與多種生物學(xué)過程，其活性受病原及環(huán)境脅迫等調(diào)節(jié)。擬南芥AtCysC1參與了對(duì)病原菌的應(yīng)答[7]。干旱脅迫能顯著提高煙草葉片和根中β-CAS活性，復(fù)水后其活性下降[5]，過表達(dá)β-CAS的煙草植株增加了對(duì)鹽脅迫的耐性，而β-CAS基因沉默植株則更易遭受氧化脅迫損傷[6]。此外，β-CAS還參與了根毛形成、種子發(fā)芽等過程[8-9]。

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）是天然橡膠的主要來源，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但橡膠樹死皮卻嚴(yán)重降低了膠園產(chǎn)量。橡膠樹是典型的生氰植物，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中含有生氰糖苷[10]和β-CAS[11]。已有研究顯示，正常樹中β-CAS酶活性很高[11]，而死皮植株中β-CAS酶活性極低[12-14]。β-CAS可能在調(diào)節(jié)橡膠樹死皮發(fā)生過程中扮演重要角色，但目前關(guān)于橡膠樹β-CAS基因的功能研究還未見報(bào)道。本研究對(duì)橡膠樹HbCAS基因進(jìn)行了克隆，并對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析，同時(shí)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)HbCAS基因在不同組織及不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)分析，從而為進(jìn)一步闡明HbCAS基因在橡膠死皮發(fā)生中的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究所用的實(shí)驗(yàn)材料為巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）品系‘熱研7-33-97，該品系于1991年定植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。采集‘熱研7-33-97穩(wěn)定葉、衰老葉、雌花、雄花、膠乳、樹皮、新梢等組織樣品，其中根部組織樣品取自移栽培養(yǎng)6個(gè)月的‘熱研7-33-97組培苗，于?80 ℃保存?zhèn)溆谩８鹘M織樣品包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取3棵樹。

選取長(zhǎng)勢(shì)相同的‘熱研7-33-97組培苗進(jìn)行過氧化氫（H2O2）、乙烯利（ETH）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）、甲基紫精（MV）、干旱處理（PEG）、低溫處理（cold）及高鹽脅迫（salt）處理。H2O2的處理參照Zhu等[15]的方法，處理濃度為20 mmol/L;ETH和MeJA的處理參照Hao等[16]的方法，處理濃度分別為10 mmol/L和200 μmol/L;ABA、SA和MV處理濃度分別為200 μmol/L、5 mmol/L和200 μmol/L。低溫處理是將組培苗置于人工氣候箱中，處理溫度為4 ℃，光照強(qiáng)度600 μmol/（m2·s），光照時(shí)間為16 h;將組培苗的培養(yǎng)基質(zhì)洗凈，根部浸泡于20%聚乙二醇6000（PEG6000）中來模擬干旱環(huán)境;采用400 mmol/L NaCl處理來模擬高鹽脅迫條件。以不做任何處理的組培苗為對(duì)照，分別在處理后3、6、12、24、48 h時(shí)采集葉片，用液氮凍存，用于RNA提取。

1.2? 方法

1.2.1? 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及HbCAS基因克隆? 膠乳提取方法參照天根（TIANGEN）公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書，其他不同組織RNA的提取方法參照BioTeKe通用植物總RNA提取試劑盒說明書。參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa Prime Script? RT reagent Kit with gDNA Eraser）說明書去除RNA里混雜的少量DNA，并按照步驟合成第一鏈cDNA。

根據(jù)擬南芥β-CAS基因序列搜索橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫，獲得與其相似的序列scaffold0194_ 110039，采用Primer3（http：//primer3.ut.ee/）軟件設(shè)計(jì)特異性引物，HbCAS-F：5?ACTGTGGAG TGTGGGAAGAG?3，HbCAS-R：5?ACCCCATC CCAAAGCACTTA?3。以橡膠樹‘熱研7-33-97膠乳cDNA為模板，用PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，擴(kuò)增體系為：cDNA模板5 μL，5×TransStart? FastPfu Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.75 μL，TransStart? FastPfu DNA Polymerase （2.5 U/μL） 0.5 μL，加入ddH2O至總體積為25 μL。PCR程序如下：95 ℃ 1 min;95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物與1 μL pEASY?-Blunt Simple Cloning Vector進(jìn)行連接，加連接產(chǎn)物于50 μL Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，鑒定為陽性的克隆送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.2? HbCAS基因序列與生物信息學(xué)分析? 采用NCBI數(shù)據(jù)庫中ORF finder（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/）查找HbCAS基因的ORF（開放閱讀框）區(qū)，推導(dǎo)出其編碼的氨基酸序列;通過在線軟件ExPASy的ProtParam（https：//web. expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)的理論分子量和等電點(diǎn);使用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）分析HbCAS基因編碼蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域;利用Signal P 4.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM Server V.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）預(yù)測(cè)HbCAS基因編碼蛋白序列的信號(hào)肽和跨膜域;使用DeepLoc1.0（http：// www.cbs.dtu.dk/services/DeepLoc/）預(yù)測(cè)HbCAS基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位;蛋白序列比對(duì)分析采用NCBI SmartBlast工具，選取與HbCAS蛋白同源的其他植物CAS蛋白序列，利用DNAMAN軟件做多序列比對(duì)分析，利用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法Neighbor-Joining構(gòu)建HbCAS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析? 根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)HbCAS基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物。HbCAS-qF：5?TAATCACTCCCGGGAAGACG-，HbCAS-qR：5?GTCACCCTTCTCTCCAAGCT?3，以橡膠樹UBC4基因（GenBank登錄號(hào)：HQ323249.1）為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異引物，HbUBC4-qF：TCACCCTGAACCTGATAGCC，HbUBC4-qR：TTTCTTTGGTGACGCTGCAA對(duì)相應(yīng)模板進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，基因相對(duì)表達(dá)量結(jié)果為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2? 結(jié)果與分析

2.1? HbCAS基因克隆與序列分析

用擬南芥的CAS序列對(duì)橡膠樹全基因組數(shù)據(jù)庫做同源比對(duì)，獲得具有完整ORF的基因序列。在該序列的ORF兩端設(shè)計(jì)特異性引物，采用PCR技術(shù)從膠乳cDNA中擴(kuò)增出的條帶與預(yù)期片段大小一致（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示，該片段長(zhǎng)度為1164 bp，ORF長(zhǎng)1113 bp。由圖2可知，HbCAS蛋白編碼370個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其理論分子量為 40.15 kDa，等電點(diǎn)為8.90。序列分析結(jié)果表明，HbCAS基因編碼蛋白不具有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，主要定位于線粒體，屬于色氨酸合成酶（tryptophan synthase beta）超家族。核苷酸序列比對(duì)顯示，該基因?qū)儆贑AS家族，將其命名為HbCAS。

2.2? HbCAS蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

選取木薯、麻風(fēng)樹、棉花、木槿、可可等10個(gè)CAS蛋白與橡膠樹HbCAS蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果表明（圖3），HbCAS蛋白與木薯MeCAS氨基酸同源性最高，相似性達(dá)91%，其次是麻風(fēng)樹JcCAS蛋白，相似性為90%。進(jìn)一步利用MEGA 6.0軟件將HbCAS蛋白與18個(gè)其他物種的CAS蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明（圖4），HbCAS蛋白與木薯MeCAS、麻風(fēng)樹JcCAS親緣關(guān)系較近，而與葡萄VvCAS、扁桃PdCAS、大麻CsCAS、苦瓜McCAS等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3? HbCAS基因的組織表達(dá)特性分析

實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果表明（圖5），HbCAS基因在巴西橡膠樹膠乳、樹皮、根、穩(wěn)定葉、衰老葉、雄花、雌花和新梢等組織中均有表達(dá)，其中在膠乳中的表達(dá)量最高，顯著高于在其他組織中的表達(dá)量。除膠乳外，HbCAS基因在衰老葉和雄花中的表達(dá)量也相對(duì)較高，均顯著高于在樹皮、根、穩(wěn)定葉、雌花和新梢中的表達(dá)，且HbCAS基因在衰老葉中的表達(dá)量顯著高于雄花;HbCAS基因在樹皮、根、穩(wěn)定葉和雌花中的表達(dá)量相對(duì)較低，且差異不顯著，在樹皮、雌花和新梢中的表達(dá)也無顯著差異。

2.4? HbCAS基因在不同處理下的表達(dá)分析

同健康樹相比，HbCAS基因在死皮樹膠乳中的表達(dá)量顯著降低（圖6）。經(jīng)脅迫和激素處理后，HbCAS基因的表達(dá)均被調(diào)節(jié)（圖7）。在H2O2、MV和低溫處理下，HbCAS基因在葉片中的表達(dá)量均呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)，其中H2O2和MV處理6 h時(shí)，HbCAS基因表達(dá)量升高至處理前的2倍左右，達(dá)到最大值，6 h后開始顯著下降;低溫處理3 h和24 h時(shí)，HbCAS基因表達(dá)量降至最低，48 h后顯著升高;在高鹽、干旱及乙烯利脅迫下，HbCAS基因的表達(dá)量整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，均在48 h顯著升高到最高值;MeJA處理下，HbCAS基因表達(dá)量整體呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢(shì)，處理6 h降至最低，約為處理前的1/3;HbCAS基因表達(dá)量在SA處理下呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)，處理后12 h表達(dá)量最高，約為處理前的2倍，處理后48 h降至處理前的1/2左右;在ABA的處理下，HbCAS基因表達(dá)量在處理后3 h升高至最高值，然后呈逐漸下降的趨勢(shì)，48 h表達(dá)量顯著降至最低值。

3? 討論

β-CAS是植物體內(nèi)氰化物解毒的關(guān)鍵酶，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫中扮演重要角色。本研究從橡膠樹中克隆了HbCAS基因，該基因編碼蛋白與同屬大戟科植物的木薯、麻風(fēng)樹CAS蛋白具有較高的序列同源性和較近的親緣關(guān)系，這表明CAS蛋白在進(jìn)化上高度保守。

HbCAS基因在膠乳、樹皮、根、穩(wěn)定葉、衰老葉、雄花、雌花和新梢等組織中均有表達(dá)，其在膠乳中的表達(dá)量最高，暗示了該基因可能在膠乳中具有關(guān)鍵功能。同健康樹相比，HbCAS基因的表達(dá)在死皮樹膠乳中受到明顯抑制。有研究顯示[12-14]，死皮樹中β-CAS酶活性顯著降低，這與本研究結(jié)果類似，暗示了死皮樹中氰化物解毒能力下降可能與橡膠樹死皮發(fā)生有關(guān)。

活性氧作為信號(hào)分子可調(diào)控植物不同的代謝反應(yīng)，當(dāng)植物受到逆境脅迫時(shí)會(huì)大量產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致活性氧的過度積累，從而造成細(xì)胞死亡，影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育[17-20]。橡膠樹死皮發(fā)生也被認(rèn)為與活性氧信號(hào)密切相關(guān)[21-22]。在本研究中，活性氧處理顯著調(diào)節(jié)了橡膠樹HbCAS基因的表達(dá)，暗示了HbCAS基因可能通過參與H2O2信號(hào)途徑進(jìn)而調(diào)節(jié)死皮的發(fā)生。生產(chǎn)上通過乙烯利刺激來增加膠乳產(chǎn)量。本研究發(fā)現(xiàn)，乙烯利刺激顯著上調(diào)了HbCAS基因的表達(dá)，暗示了HbCAS基因可能在乙烯調(diào)節(jié)的膠乳產(chǎn)生中發(fā)揮作用。HbCAS基因的表達(dá)也被MeJA、SA和ABA等激素調(diào)控，說明HbCAS基因參與了MeJA、SA和ABA等多種激素信號(hào)的應(yīng)答。

此外，HbCAS基因的表達(dá)也受多種非生物脅迫調(diào)節(jié)，如甲基紫精、干旱、低溫及鹽脅迫等。Yu等[6]發(fā)現(xiàn)在煙草中過量表達(dá)β-CAS基因能增加植株對(duì)鹽脅迫的耐性。本研究顯示，鹽脅迫顯著上調(diào)了HbCAS基因的表達(dá)，推測(cè)HbCAS基因可能在橡膠樹鹽脅迫應(yīng)答中具有重要功能。干旱脅迫下，HbCAS基因的表達(dá)顯著上調(diào)，Liang等[5]也發(fā)現(xiàn)干旱脅迫顯著上調(diào)煙草葉片和根中β-CAS活性，這與本研究結(jié)果類似，暗示了CAS基因參與了干旱脅迫應(yīng)答。

綜上所述，本研究從巴西橡膠樹中克隆了HbCAS基因，該基因ORF長(zhǎng)為1113 bp，編碼370個(gè)氨基酸。HbCAS基因具有組織特異性表達(dá)，在死皮樹中表達(dá)明顯下調(diào)。H2O2及乙烯利、MeJA、SA和ABA等多種激素調(diào)節(jié)了HbCAS基因的表達(dá)，同時(shí)，干旱、低溫、甲基紫精、高鹽等多種非生物脅迫也調(diào)控了HbCAS基因的表達(dá)。這些結(jié)果暗示了HbCAS基因可能在橡膠樹死皮發(fā)生、活性氧信號(hào)、激素調(diào)節(jié)及多種非生物脅迫應(yīng)答中扮演重要角色。本研究為進(jìn)一步闡明HbCAS基因在橡膠樹死皮發(fā)生中的功能奠定了理論基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：黃東杰