謝小杰 余海霞 范志毅 黃方 劉源 莫嘯 曾學(xué)梅 何新華 羅聰

摘? 要：SEPALLATA3（SEP3）屬于MADS-box基因家族，與植物的成花時(shí)間和花器官分化有關(guān)。在本研究中，從芒果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘獲得了2個(gè)MiSEP3s基因，分別命名為MiSEP3-1和MiSEP3-2。生物信息學(xué)分析顯示，MiSEP3-1和MiSEP3-2基因的基因組DNA長度分別為4189 bp和3721 bp，2個(gè)基因的開放閱讀框長度一致均為732 bp，編碼244個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量分別為59.29 kD和59.28 kD。2個(gè)MiSEP3s的氨基酸序列中含有典型的MADS結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域。啟動子序列分析顯示，2個(gè)MiSEP3s基因啟動子均包含光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、逆境響應(yīng)元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，但調(diào)控元件種類和數(shù)量存在差異?；虮磉_(dá)模式分析顯示，2個(gè)MiSEP3s基因在營養(yǎng)期的莖、葉和芽中表達(dá)量較低，但在成花轉(zhuǎn)變后期的芽中持續(xù)上調(diào)表達(dá)，在花中達(dá)到表達(dá)高峰。該結(jié)果為MiSEP3基因功能的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：芒果;SEPALLATA3;生物信息學(xué);啟動子;表達(dá)模式

中圖分類號：S667.7????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Bioinformatics and Expression Analysis of SEPALLATA3 in Mango

XIE Xiaojie， YU Haixia， FAN Zhiyi， HUANG Fang， LIU Yuan， MO Xiao， ZENG Xuemei， HE Xinhua， LUO Cong*

College of Agriculture， Guangxi University / State Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropical Agricultural Biological Resources， Nanning， Guangxi 530000， China

Abstract： SEPALLATA3 （SEP3） belongs to MADS-box gene family and is related to the flowering time and floral organ development of plants. In this study， two MiSEP3s genes which named MiSEP3-1 and MiSEP3-2 were obtained from mango transcriptome data. Bioinformatics analysis showed that the genomic length of MiSEP3-1 and MiSEP3-2 was 4189 bp and 3721 bp， respectively. Both genes had the same length of open reading frame and encoded 244 amino acids， with molecular weights 59.29 kD and 59.28 kD， respectively. Furthermore， MiSEP3-1 and MiSEP3-2 contained typical MADS and K-box domains. Promoter sequences analysis showed that MiSEP3s promoters both contained photoresponse elements， hormone response elements， stress response elements and transcription factor binding sites， but there were differences in the types and number of regulatory elements. Expression analysis showed that MiSEP3s were lower expressed in stem， leaf and bud at the vegetative stage， but significantly continuously up-regulated expression with the development of the flower and reached the expression peak in the flower. This study would provide references for the function study of MiSEP3.

Keywords： mango; SEPALLATA3; bioinformatics; promoter; expression pattern

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.007

開花是高等植物個(gè)體發(fā)育的中心環(huán)節(jié)，是植物從營養(yǎng)階段向生殖階段的過渡，20世紀(jì)90年代，繼Coen等[1]提出植物花器官發(fā)育的ABC模型后，Theiben等[2]于2001年又提出了ABCDE模型，并認(rèn)為ABCDE等5類功能基因共同作用控制植物花器官的形成。SEP類基因構(gòu)成植物MADS-box基因家族的一個(gè)亞家族[3]，包括SEPALLATA （SEP3/AGL2）、SEP2 （AGL4）、SEP3 （AGL9）和SEP4 （AGL3） 4個(gè)基因，組成了擴(kuò)展ABCDE花卉發(fā)育模式的E類，都主要在花組織中表達(dá)，它們?nèi)哂嗟貐⑴c4種花器官（萼片、花瓣、雄蕊和心皮）的發(fā)育和花分生組織的確定，是花器官發(fā)育所必需的基因，參與了花分生組織的整個(gè)過程[4]。已有研究表明，在花器官的發(fā)展中，SEP亞家族在調(diào)控植物生長發(fā)育的蛋白質(zhì)相互作用中起著至關(guān)重要的作用[5]。擬南芥AtSEP3可能通過與開花促進(jìn)因子SOC1和AGL24發(fā)生蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-靶基因之間的相互作用而對成花轉(zhuǎn)變過程進(jìn)行負(fù)控制[6]。目前已從擬南芥（Arabidopsis thaliana）[7]、桃（Purnus pesrica）[8]、甜櫻桃（Prunus avium）[9]、毛白楊（Populus tomentosa）[10]等植物中克隆了SEP3基因。

芒果（Mangifera indica L.）是一種原產(chǎn)印度的漆樹科多年生木本植物，是重要的熱帶、亞熱帶果樹，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國主要分布在海南、廣西、云南、四川、廣東和福建等地，已成為我國熱區(qū)農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)[11-12]，但芒果的童期比較長，這嚴(yán)重阻礙了芒果新品種的選育[13]。目前已挖掘出一些芒果成花的相關(guān)基因，比如在擬南芥中過表達(dá)MiSOC1基因[14]、MiAP1基因[15]和MiFT基因[16]可以顯著促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株的成花時(shí)間，但過表達(dá)MiCO基因會導(dǎo)致擬南芥出現(xiàn)晚花表型[17]。目前尚未見關(guān)于芒果MiSEP3基因的研究報(bào)道。因此本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，從芒果的轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)中挖掘獲得了2個(gè)SEP3s基因的編碼區(qū)序列、DNA序列和啟動子序列，并對這些序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析了2個(gè)SEP3s基因在芒果不同組織器官和成花發(fā)育不同階段的表達(dá)模式，為進(jìn)一步揭示SEP3基因在調(diào)控芒果開花方面的功能提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

芒果品種為‘四季蜜芒（Mangifera indica L. cv. ‘SiJiMi），栽培于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院果樹標(biāo)本園。不同組織器官樣本和不同發(fā)育時(shí)期樣本分別于2018年11月5日、12月5日，2019年1月4日、1月29日、3月6日，分別采集成熟葉、成熟莖和芽/花（3月6日采集花，其余時(shí)期采集芽）。所有樣品采集后立即保存于–80 ℃冰箱備用。

1.2? 方法

1.2.1? 芒果MiSEP3基因序列的獲得與生物信息學(xué)分析? 根據(jù)芒果轉(zhuǎn)錄組的基因注釋信息，獲得SEP3基因的編碼區(qū)序列，進(jìn)一步通過同源比對的方法，從‘四季蜜芒基因組數(shù)據(jù)中挖掘獲得SEP3基因的DNA序列和啟動子序列。利用BioXM 2.6軟件推測SEP3基因的氨基酸序列;利用IBS 1.0軟件生成SEP3基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。利用GenBank Blast在線軟件（http：//www ncbi nlm nih gov/BLAST/）分析芒果SEP3同源基因與其他植物SEP3基因核苷酸序列同源性以及保守結(jié)構(gòu)域;用MEGA 6.0軟件采用鄰接法（neighbour-joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用DNAMAN軟件進(jìn)行2個(gè)基因啟動子序列的對比，利用植物順式元件數(shù)據(jù)庫PLANTCARE和NEW PLACE進(jìn)行MiSEP3基因約2000 bp啟動子區(qū)域順式元件的分析。

1.2.2? 芒果MiSEP3基因的表達(dá)分析? 使用天根生化科技（北京）有限公司的RNA perp Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取‘四季蜜芒不同組織及不同發(fā)育時(shí)期花的樣品總RNA，采用TaKaRa公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，引物采用T18，第一鏈合成的反應(yīng)體系與程序參照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)基因全長序列設(shè)計(jì)定量引物，以芒果MiActin1為內(nèi)參[18]，引物設(shè)計(jì)采用在線設(shè)計(jì)軟件Primer3 Input（http：// primer3.ut.ee/）（表1）。按SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa，中國大連）使用說明進(jìn)行qRT-PCR分析。使用ABI 7500 Real Time PCR（Applied Biosystems，美國加利福尼亞）進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)操作步驟、反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序參照儀器和試劑說明書進(jìn)行，每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2–CT法[19]進(jìn)行相對表達(dá)量分析。使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，利用Excel 2007軟件作圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 芒果MiSEP3基因的序列分析

從芒果轉(zhuǎn)錄組和基因組中篩選出2個(gè)MiSEP3s的cDNA和DNA序列，分別命名為MiSEP3-1（GenBank登錄號：MW284816）和MiSEP3-2（GenBank登錄號：MW284817）。MiSEP3-1和MiSEP3-2基因DNA序列長度分別為4189 bp和3721 bp，編碼區(qū)長度均為732 bp。外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析顯示，2個(gè)基因均包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，并且每個(gè)對應(yīng)的外顯子長度一致，但內(nèi)含子長度存在差異（圖1）。MiSEP3-1和MiSEP3-2均編碼了244個(gè)氨基酸，

所編碼的氨基酸序列見圖2。用ProtParam工具進(jìn)行蛋白基本理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，MiSEP3-1蛋白的分子質(zhì)量為59.29 kD，等電點(diǎn)為4.96;MiSEP3-2蛋白的分子量為59.28 kD，等電點(diǎn)為4.96。

2.2? 芒果 MiSEP3蛋白同源性及進(jìn)化樹分析

通過NCBI-Conserved Domain Search預(yù)測到2個(gè)MiSEPs蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示都含有MADS-box和K-box結(jié)構(gòu)域，屬于MADS-box基因家族，同源性比對分析顯示，MiSEP3-1和MiSEP3-2基因的核苷酸和氨基酸同源性分別為93.61%和93.03%，同源性較高。

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載不同物種的SEP和SEP- like的氨基酸序列，用MEGA 6.0軟件構(gòu)建芒果SEP3蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示整個(gè)進(jìn)化樹被分為4個(gè)獨(dú)立的分支，芒果MiSEP3s與阿月渾子（Pistacia vera）PvSEP3和毛果楊（Populus tric-hocarpa）PtSEP3親緣關(guān)系最近聚在一類，而與擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtSEP3最遠(yuǎn)（圖3）。

2.3? 芒果MiSEP3基因啟動子序列分析

利用DNAMAN軟件對2個(gè)MiSEP3基因啟動子序列進(jìn)行對比，結(jié)果顯示，2個(gè)基因啟動子的同源性僅為47.16%（圖4）。利用在線軟件NEW PLACE和Plant CARE對2個(gè)MiSEP3s基因約2000 bp的啟動子序列進(jìn)行順式作用元件的功能及數(shù)量進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如表2所示，2個(gè)MiSEP3s基因啟動子的調(diào)控元件種類和數(shù)量存在差異，但2個(gè)基因均具有多種光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、逆境響應(yīng)元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等。比如SEP3-1有4個(gè)光調(diào)控相關(guān)元件，而SEP3-2有3個(gè)光調(diào)控相關(guān)元件，但多出1個(gè)與晝夜節(jié)律相關(guān)的元件。SEP3-1有8個(gè)激素調(diào)控元件，而SEP3-2有6個(gè)激素響應(yīng)元件，但彼此之間元件的類型和出現(xiàn)的次數(shù)存在差異。SEP3-1和SEP3-2均含有2種不同的脫落酸（ABA）調(diào)控元件;SEP3-1含有2種生長素調(diào)控元件，而SEP3-2只有1種，且種類不同于SEP3-1;SEP3-1含有2種赤霉素調(diào)控元件，SEP3-2只含有1種赤霉素調(diào)控元件，且種類不同于SEP3-1。SEP3-1和SEP3-2均含有多個(gè)Dof、MYC、MYB、AGL15等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。由此可以推測MiSEP3基因的表達(dá)可能受光、植物激素和逆境脅迫等因素的調(diào)控。

2.4? 芒果MiSEP3基因在不同器官以及不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

為了研究芒果MiSEP3基因在不同組織以及成花不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)，以‘四季蜜芒為材料，檢測MiSEP3-1和MiSEP3-2的表達(dá)模式，結(jié)果見圖5。MiSEP3-1和MiSEP3-2基因在‘四季蜜芒不同發(fā)育時(shí)期的不同組織中均有表達(dá)，但存在表達(dá)水平的差異，但2個(gè)MiSEP3s基因的表達(dá)模式類似。

在營養(yǎng)生長期，MiSEP3-1和MiSEP3-2基因在各個(gè)組織中均表達(dá)，但表達(dá)水平均較低，其中在芽中MiSEP3-2基因的表達(dá)水平顯著高于MiSEP3-1基因。MiSEP3-1基因在成花誘導(dǎo)期和花芽分化期葉片中的表達(dá)水平高于營養(yǎng)生長期葉片的表達(dá)水平，而在頂芽中先略有降低，而后再次升高;MiSEP3-2基因在葉片中的表達(dá)模式與MiSEP3-1基因一致，但在頂芽中，MiSEP3-2基因的表達(dá)水平持續(xù)上升。從花芽分化后期開始，2個(gè)MiSEP3s基因在頂芽中的表達(dá)水平急劇上升，而在盛開的花中達(dá)到表達(dá)高峰，而此時(shí)2個(gè)基因在葉片中的表達(dá)水平也達(dá)到表達(dá)高峰。但在整過成花過程中，2個(gè)MiSEP3s基因在莖中的表達(dá)水平一直維持在較低水平。

3? 討論

SEP亞家族基因在植物花器官的分化和發(fā)育過程中發(fā)揮著非常重要的作用[20]，SEP類基因參與花器官發(fā)育和植物開花的調(diào)控[21]。在擬南芥中有4個(gè)E類基因：SEP1、SEP2、SEP3和SEP4，研究表明SEP1/2/3/4基因參與四輪花器官的發(fā)育，SEP3蛋白可以形成多聚體復(fù)合物決定花器官的形成和發(fā)育，且促使植物早開花[4， 20-21]。目前，已從許多植物中分離出了SEP類基因。在懸鈴木（Platanus acerifolia）中，鑒定獲得了2個(gè)SEP3s基因[22]。在番紅花（Crocus sativus L.）中，克隆獲得了4個(gè)SEP3基因[23]。在本研究中，從芒果轉(zhuǎn)錄組和基因組中挖掘獲得2個(gè)SEP3s基因MiSEP3-1和MiSEP3-2，說明在不同物種中SEP3基因存在的拷貝數(shù)存在差異。

啟動子對基因的表達(dá)起重要的調(diào)控作用，通過啟動子可以改變基因的表達(dá)量進(jìn)而影響植物的表型[24]。因此啟動子的研究是基因工程和基因表達(dá)研究中的關(guān)鍵之一[25]。啟動子除具有典型的核心啟動元件外，還有眾多與基因功能相關(guān)的調(diào)節(jié)元件。比如王靜澄等[26]克隆分析毛白楊PtSEP3-1基因啟動子發(fā)現(xiàn)，在PtSEP3-1基因啟動子序列內(nèi)含有大量光響應(yīng)元件ACE、Box I和Box 4等，此外還有脫落酸響應(yīng)元件ABRE，赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif以及脅迫響應(yīng)元件HSE、TC-rich repeats等。本研究也得到了類似的結(jié)果，在MiSEP3基因啟動子中發(fā)現(xiàn)了赤霉素響應(yīng)元件WRKY71OS和MYBGAHV，脫落酸響應(yīng)元件ABRE，以及大量的光響應(yīng)元件。

在擬南芥中，SEP3有2個(gè)基因AtSEP3-2和AtSEP3- AtSEP3-2在根和莖中不表達(dá)，在葉片中表達(dá)量很低，在花器官中表達(dá)水平明顯增加，AtSEP3-3在根和莖中幾乎檢測不到信號，而在葉片中開始積累，在雌蕊中的表達(dá)量最高[27]。蓮NnSEP3基因在不同生長組織中表達(dá)不一，主要在花中表達(dá)[28];重瓣百合LiSEP3主要在花中表達(dá)，其中在最內(nèi)側(cè)花瓣中表達(dá)量最高[29];說明SEP-like基因可能在花形態(tài)建成和生殖生長中發(fā)揮重要作用。盡管SEP3表達(dá)模式存在差異，但其表達(dá)在許多物種中表現(xiàn)出高度的生殖器官特異性，比如在番茄[30]、煙草[31]、青島百合[32]的花器官中高度表達(dá)。本研究中，MiSEP3-1和MiSEP3-2在‘四季蜜芒成花過程不同時(shí)期內(nèi)的各組織中均有表達(dá)，二者均在營養(yǎng)期的莖、葉和芽中表達(dá)量較低，在花芽分化后期的芽/花中高度表達(dá)，這表明MiSEP3-1和MiSEP3-2基因在花芽分化之后才逐漸積累，說明SEP3基因在花的形成和發(fā)育過程中起著重要作用，但其功能尚需要進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：謝龍蓮