超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中16種喹諾酮類(lèi)藥物殘留

袁荷芳 耿成鋼 高蕙文 蔣曉勤 余花

隨著生活水平的不斷提高，人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)和安全越來(lái)越關(guān)注，在追求營(yíng)養(yǎng)豐富的同時(shí)，也希望享用綠色、無(wú)公害、低殘留的農(nóng)產(chǎn)品。但目前抗生素在獸醫(yī)臨床和飼料中大量使用，導(dǎo)致獸藥殘留的問(wèn)題越來(lái)越突出。其中，喹諾酮（quinolone antibiotics，QNs）是一類(lèi)高效且價(jià)格低廉的廣譜抗菌藥，廣泛應(yīng)用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，成為影響水產(chǎn)品和肉制品質(zhì)量安全的主要因素。國(guó)際食品法典委員會(huì)、歐盟、日本及中國(guó)均制訂出相應(yīng)的最高殘留限量，根據(jù)不同動(dòng)物品種、組織和藥物種類(lèi)，QNs的最高殘留限量為10-6000μg/kg。

關(guān)于喹諾酮類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)方法，目前應(yīng)用較多的是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、高效液相色譜-熒光法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等，其中，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在喹諾酮類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)中應(yīng)用較多。本文建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，可以同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中16種喹諾酮類(lèi)藥物殘留。具體來(lái)說(shuō)，先在樣品中加入1%的乙酸-乙腈，再依次進(jìn)行漩渦混合、超聲波提取、正己烷去脂、氮吹，然后用0.2%的甲酸水溶液復(fù)溶，經(jīng)C18色譜柱分離后，采用0.2%的甲酸水和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，最后在ESI+模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組分在5-200ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.996;檢出限為0.5-1.0μg/kg，定量限為1.0-2.0μg/kg，3個(gè)添加水平（n=6）的回收率為79.3%-99.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%-8.8%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本文建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速、靈敏、準(zhǔn)確，適用于水產(chǎn)品中喹諾酮的檢測(cè)。

一、儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）QTRAP 4500，SCIEX;高速冷凍離心機(jī)X4 PRO，ThermoFisher;IKA MS3漩渦混合器，IKA;Milli-Q超純水儀，Millipore;色譜純乙腈、甲醇，Merck;喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于Dr。

二、溶液的配制

1.標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱(chēng)取按其濃度折算為100%質(zhì)量的16種喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品各10mg（精確至0.0001g），置于10mL容量瓶中，用1%的乙酸乙腈溶解并定容至刻度，濃度為1mg/mL。在4℃條件下避光保存，有效期6個(gè)月。

2.混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.1mL于100mL容量瓶中，用1%的乙酸乙腈定容，配制成濃度為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

3.混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別準(zhǔn)確移取0.1mL、0.2mL、0.4mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于10mL容量瓶中，用空白樣品基質(zhì)溶液定容至刻度，配制成濃度分別為5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

三、實(shí)驗(yàn)與方法

1.樣品前處理。稱(chēng)取5g（精確到0.01g）均質(zhì)試樣于50mL離心管中，加入10g無(wú)水硫酸鈉，渦旋混勻，再加入1%的乙酸乙腈溶液15mL，超聲提取10min，在10℃以下8000r/min離心5min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至另一潔凈的離心管中。重復(fù)上述提取1次，合并上清液，加入10mL正己烷，混合1min，在10℃以下8000r/min離心5min，棄去正己烷層。加入5mL異丙醇，渦旋混勻，氮吹至近干。用2mL初始流動(dòng)相溶解殘?jiān)?，再加?mL正己烷，渦旋1min，8000r/min離心5min。棄去上層（正己烷層），過(guò)0.22μm濾膜，待測(cè)定。

2.液相色譜條件。色譜柱為T(mén)hermo Hypersil GOLD C18（2.1mm×50mm，1.9?m），流速為0.2mL/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為2μL，流動(dòng)相A為0.2%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫條件如表1所示。

3.質(zhì)譜條件。離子化方式：電噴霧電離;掃描方式：正離子掃描;檢測(cè)方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè);離子源溫度：550℃;電噴霧電壓：5500V;氣簾氣壓力：35psi;霧化氣壓力：55.0psi;輔助氣壓力：55.0psi。

四、結(jié)果與分析

1.質(zhì)譜條件的優(yōu)化。喹諾酮類(lèi)化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有羰基等多電子基團(tuán)，易于在ESI源的正離子模式下形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子。配制含16種喹諾酮（100ng/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用針泵進(jìn)樣方式將其注入離子源，在正離子檢測(cè)模式下進(jìn)行優(yōu)化，確定碎片離子有最大響應(yīng)強(qiáng)度時(shí)的最佳碰撞電壓值。

2.色譜條件的優(yōu)化。使用濃度為10ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察液相色譜流動(dòng)相類(lèi)型和酸度對(duì)靈敏度和分離度的影響。喹諾酮類(lèi)化合物為酸堿兩性化合物，其解離狀態(tài)和在流動(dòng)相中的溶解性隨流動(dòng)相的pH值而變化，在流動(dòng)相中加入一定比例的有機(jī)酸可以顯著提高兩性喹諾酮的分離度和離子化效率。本實(shí)驗(yàn)分別采用濃度為0.1%、0.2%和0.3%的甲酸水溶液作為流動(dòng)相，比較酸性增強(qiáng)，峰型有所改善，響應(yīng)提高;當(dāng)甲酸比例超過(guò)0.2%時(shí)，多數(shù)化合物響應(yīng)有所降低，綜合考慮，選擇濃度0.2%的甲酸溶液作為水相流動(dòng)相。

3.前處理方法優(yōu)化。喹諾酮類(lèi)化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有羧基和叔胺基，因此具有酸堿兩性性質(zhì)，易溶于酸性或堿性溶液。本實(shí)驗(yàn)分別采用純有機(jī)溶劑和添加一定比例乙酸的有機(jī)溶劑提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈能夠使樣品蛋白質(zhì)變性，利于目標(biāo)物的提取;添加了乙酸的有機(jī)溶液可以顯著提高回收率，酸性增強(qiáng)，有利于目標(biāo)化合物的提取，但有機(jī)酸比例過(guò)高則不利于濃縮，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)采用濃度為1%的乙酸乙腈溶液進(jìn)行提取。

4.基質(zhì)效應(yīng)的影響。由于基質(zhì)效應(yīng)的存在，基質(zhì)提取液和純?nèi)軇┲心繕?biāo)分析物在質(zhì)譜中的響應(yīng)不同，根據(jù)目標(biāo)分析物質(zhì)譜信號(hào)消減和增強(qiáng)，基質(zhì)效應(yīng)的影響可分為離子抑制和離子增強(qiáng)兩種情況，不同樣品基質(zhì)對(duì)各種喹諾酮類(lèi)化合物離子化的抑制情況存在顯著差異。為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響，本實(shí)驗(yàn)以空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，可使標(biāo)準(zhǔn)和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而降低了樣品基質(zhì)效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，能夠同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中16種喹諾酮類(lèi)藥物殘留，快速、靈敏、準(zhǔn)確，適用于水產(chǎn)品中喹諾酮的檢測(cè)，也能為水產(chǎn)品的安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與監(jiān)管工作提供技術(shù)支持。

作者簡(jiǎn)介：袁荷芳（1984-），女，漢族，江蘇常州人，碩士研究生，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槭称防砘瘷z驗(yàn)。

*通信作者：蔣曉勤（1988-），女，漢族，江蘇常州人，碩士研究生，主管藥師，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)。