時(shí)翠銷，王 剛，李亞娟，黃 穎，徐元宏

B群鏈球菌(group B

Streptococcus

，GBS)又名無乳鏈球菌，常寄居于呼吸道、泌尿生殖道、胃腸道，是一種重要的人類機(jī)會(huì)致病菌，引起多種侵襲性疾病。 雖然醫(yī)院感染最常見的致病菌為革蘭陰性桿菌，但是GBS在20世紀(jì)90年代已成為成人急性泌尿系統(tǒng)感染的重要原因，關(guān)于尿路感染的GBS耐藥特征及耐藥基因研究較少。CAMP反應(yīng)基于

cfb

基因編碼的CAMP因子的促溶血活性，CAMP因子在金黃色葡萄球菌分泌的鞘磷脂酶的作用下引起紅細(xì)胞膜裂解，產(chǎn)生的溶血反應(yīng)臨床上常用于鑒定GBS。最近，也有研究用PCR檢測(cè)

cfb

基因來鑒定GBS。自21世紀(jì)初以來，已有在針對(duì)牛乳腺炎的研究中分離出CAMP陰性的GBS。該研究對(duì)尿液標(biāo)本中分離的51株GBS進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)及耐藥基因檢測(cè)，以了解尿路感染GBS的耐藥特征，為臨床合理使用抗生素提供參考；探究CAMP試驗(yàn)和

cfb

基因作為臨床鑒定GBS指標(biāo)的敏感性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與鑒定

收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2019年6月—2020年9月保存的來自尿液標(biāo)本的GBS共51株，已去除相同患者及因凍存不當(dāng)死亡的菌株。菌種接種于羊血平板，長(zhǎng)出菌落后，進(jìn)行觸酶試驗(yàn)，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS，法國(guó)生物梅里埃公司) 重新鑒定，質(zhì)譜鑒定實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 8739 。

1.2 CAMP試驗(yàn)

研究使用2個(gè)批次哥倫比亞羊血平板(合肥天達(dá)診斷試劑有限公司)，無乳鏈球菌ATCC 13813和化膿鏈球菌ATCC 19615分別為陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控菌株。將產(chǎn)溶血素的金黃色葡萄球菌ATCC 25923在血瓊脂平板上劃一橫線，再取收集的GBS與前一劃線作垂直接種，兩者相距0.5～1 cm, 接種后，將羊血平板在35～37 ℃需氧培養(yǎng)18～24 h。采用2個(gè)批次的血平板做重復(fù)實(shí)驗(yàn)，垂直線交界處的β-溶血的箭頭形區(qū)域?yàn)殛?yáng)性CAMP反應(yīng)，彩虹樣細(xì)溶血區(qū)域?yàn)槿蹶?yáng)性CAMP反應(yīng)，無溶血區(qū)域?yàn)殛幮訡AMP反應(yīng)。

1.3 細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法(英國(guó)Oxoid公司)和Vitek 2 Compact 自動(dòng)化微量肉湯稀釋法(法國(guó)梅里埃生物公司)進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果判讀及解釋參照CLSI和EUCAST文件進(jìn)行。

1.4 紅霉素誘導(dǎo)的克林霉素耐藥檢測(cè)

紅霉素耐藥、克林霉素敏感或中介的GBS, 紅霉素(15 μg/片)和克林霉素(2 μg/片)藥敏紙片邊緣相隔12 mm放置。35 ℃培養(yǎng)18～24 h，靠近紅霉素藥敏紙片一側(cè)的克林霉素抑菌圈出現(xiàn)“截平”現(xiàn)象，即誘導(dǎo)克林霉素耐藥試驗(yàn)陽(yáng)性，為誘導(dǎo)表型(iMLSB)。

1.5 耐藥基因、16S rRNA及

基因檢測(cè)

參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、喹諾酮類等抗生素耐藥基因引物，以及16S rRNA、

cfb

基因引物，引物均由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。煮沸法提取細(xì)菌總DNA：將菌種接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，35 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取新鮮的單克隆菌落于500 μl TE緩沖液中，振蕩器上渦旋混勻后于水浴鍋中煮15 min，冰上放置5 min后，12 000 r/min離心10 min，離心后取300 μl上清液為DNA模板。PCR擴(kuò)增耐藥基因條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，42～55 ℃退火60 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離(1.2%，110 V，40 min)，并由上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank上的核苷酸庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)。

表1 16S rRNA、cfb及耐藥基因引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用WHONET 5.6軟件對(duì)細(xì)菌藥物敏感性結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算PCR法檢測(cè)耐藥基因、16S rRNA 和

cfb

基因的檢出率。

2 結(jié)果

2.1 感染GBS患者的一般臨床資料及科室分布

51例感染GBS的患者中，男性23例，女性28例，男女比例為1 ∶1.2。易感人群為中老年群體，年齡≥45歲的有41例(80.4%)，<45歲的僅有10例(19.6%)。患者主要分布在泌尿外科和內(nèi)分泌科，分別為24例(47.1%)、16例(31.4%)，風(fēng)濕免疫科、血液內(nèi)科、皮膚性病科、國(guó)際醫(yī)療全科醫(yī)學(xué)科各1例(2%)，腎臟內(nèi)科5例(9.8%)，消化內(nèi)科2例(3.9%)。

2.2 CAMP試驗(yàn)結(jié)果

51株GBS中，CAMP陰性3株，弱陽(yáng)性9株，陽(yáng)性39株。見圖1。

圖1 CAMP試驗(yàn)結(jié)果A：1、2、3為CAMP試驗(yàn)陰性；B：4、5、6為CAMP試驗(yàn)弱陽(yáng)性；C：7、8、9為CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性；P：陽(yáng)性對(duì)照；N：陰性對(duì)照

2.3 細(xì)菌藥物敏感性分析

藥物敏感性結(jié)果顯示，51株GBS對(duì)氨芐西林、達(dá)托霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、青霉素、奎奴普丁/達(dá)福普汀、替加環(huán)素、萬(wàn)古霉素均敏感，對(duì)喹諾酮類抗生素左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、莫西沙星及克林霉素比較敏感，耐藥率分別為47.1%、49.0%、47.1%、49.0%，對(duì)四環(huán)素、紅霉素耐藥性高，耐藥率均為66.7%。紅霉素、克林霉素均敏感型10株，紅霉素耐藥的34株GBS中，有22 株 (64.7%)為固有表型(cMLSB)，5株 (14.7%) 為iMLSB型，M型有7株 (20.6%)，克林霉素耐藥的25株GBS中L型有3株 (12%)。見表2。

表2 尿液中51株GBS藥敏結(jié)果[n(%)]

2.4 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

通過對(duì)尿液中51株GBS的紅霉素耐藥基因ermA、ermB、mefA/E，克林霉素耐藥基因linB，四環(huán)素耐藥基因tetM、tetO, 喹諾酮耐藥基因gyrA、parC進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序顯示，所有耐藥基因均有檢出，ermA、ermB、mefA/E檢出率分別為43.1%、51.0%、33.3%，linB檢出率為11.8%，tetM、tetO檢出率分別為43.1%、23.5%，40株GBS同時(shí)檢出gyrA、parC，檢出率為78.4%，無單獨(dú)檢出gyrA或parC的GBS。GBS耐藥菌株與其攜帶相關(guān)耐藥基因具有一定相關(guān)性，34株紅霉素耐藥的GBS都至少含有一種紅霉素耐藥基因，34株四環(huán)素耐藥菌株32株(94.1%)含有四環(huán)素耐藥基因，喹諾酮耐藥的菌株均含gyrA、parC耐藥基因，14株喹諾酮抗生素敏感的GBS也含有g(shù)yrA、parC耐藥基因，25株克林霉素耐藥的GBS僅有6株含有l(wèi)inB耐藥基因。見表3。

表3 51株GBS耐藥基因分布情況

2.5 16S rRNA和

基因檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)PCR檢測(cè)顯示，51株GBS 16S rRNA檢出率為100%，

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基因檢出47株，檢出率92.2% (47/51)，其中CAMP試驗(yàn)陰性株有1株

cfb

基因陽(yáng)性(1/3)，弱陽(yáng)性株7株陽(yáng)性(7/9)，CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性株

cfb

基因全部陽(yáng)性(39/39)。PCR檢測(cè)結(jié)果見圖2、3和表4。

表4 51株GBS基因分布情況[n(%)]

圖2 16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增M1：marker 2000；1～3：CAMP試驗(yàn)陰性株；4～6：CAMP試驗(yàn)弱陽(yáng)性株；7～9：CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性株

圖3 cfb基因的PCR擴(kuò)增M2：marker 2000；1～3: CAMP試驗(yàn)陰性株；4～6：CAMP試驗(yàn)弱陽(yáng)性株；7～9：CAMP試驗(yàn)陽(yáng)性株

2.6 菌株鑒定結(jié)果

經(jīng)生化試驗(yàn)、16S rRNA、

cfb

基因、MALDI-TOF MS鑒定，

cfb

、16S rRNA測(cè)序結(jié)果BLAST比對(duì)，與GBS (登錄號(hào)：CP008813.1)同源性約為99%。觸酶試驗(yàn)陰性，16S rRNA、MALDI-TOF MS 鑒定結(jié)果均為GBS。CAMP試驗(yàn)分別為陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性的三株菌株鑒定結(jié)果見表5。

表5 菌株鑒定結(jié)果

3 討論

GBS可引起嚴(yán)重感染，特別是新生兒和產(chǎn)婦多見，如新生兒敗血癥、產(chǎn)后敗血癥、心內(nèi)膜炎和細(xì)菌性關(guān)節(jié)炎。近年來，GBS成為成人尿路感染的重要病原體。GBS分離株的藥物敏感性試驗(yàn)對(duì)于合理選擇抗生素至關(guān)重要，本研究中51株GBS均分離自尿液標(biāo)本，對(duì)氨芐西林、達(dá)托霉素、利奈唑胺、呋喃妥因、青霉素、奎奴普丁/達(dá)福普汀、替加環(huán)素、萬(wàn)古霉素敏感性都為100%，對(duì)四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、喹諾酮類抗生素耐藥率高。藥敏結(jié)果表明，尿路感染的GBS與其他路徑感染的GBS耐藥特征總體相仿，但對(duì)紅霉素及四環(huán)素耐藥率高(66.7%)，iMLSB型有5株，臨床上應(yīng)報(bào)告分離株克林霉素耐藥。

青霉素是成人侵襲性GBS疾病的一線治療藥物，目前普遍認(rèn)為GBS在體外對(duì)青霉素敏感，在來自日本的分離株中檢測(cè)到青霉素敏感性降低，被認(rèn)為是青霉素結(jié)合蛋白(PBP)2X表達(dá)降低所致。本研究中，尿路感染的GBS菌株對(duì)青霉素敏感性為100%，表明青霉素仍是治療GBS感染的較佳選擇，而對(duì)青霉素過敏的患者,可用紅霉素和克林霉素替代。研究中觀察到54.9%的分離株多重耐藥，以紅霉素、克林霉素和四環(huán)素共耐藥(27.5%)為主。

紅霉素和四環(huán)素的耐藥率 (66.7%) 較高，主要耐藥基因?yàn)閑rmB和tetM，廣東地區(qū)紅霉素耐藥也是主要由ermB介導(dǎo)，25株克林霉素耐藥的GBS僅檢出6株介導(dǎo)克林霉素耐藥的linB基因，這與中國(guó)南方地區(qū)(24.6%)的檢出率一致，低于南非的研究結(jié)果，而在韓國(guó)的一些調(diào)查中沒有檢測(cè)到linB基因，5株含有l(wèi)inB基因的GBS為紅霉素和克林霉素同時(shí)耐藥的cMLSB型，表明linB基因也可能與紅霉素耐藥有關(guān)。有研究指出parC第79位密碼子和第83位密碼子突變是高水平喹諾酮類耐藥的主要決定因素。本研究中，喹諾酮類抗生素耐藥的GBS gyrA和parC均有檢出，但是也有檢出14株喹諾酮敏感的GBS，這可能與gyrA和parC不表達(dá)有關(guān)，或者存在其他調(diào)節(jié)喹諾酮抗生素耐藥的基因或途徑。

GBS表達(dá)的CAMP因子是一種成孔蛋白毒素，其在分子水平上的協(xié)同溶血作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究中分離出3株CAMP陰性的GBS, Hassan et al研究認(rèn)為CAMP陰性株均含有

cfb

基因，與之相反，Abdulmawjood et al分離的4株表型CAMP陰性的GBS,

cfb

基因均為陰性，本研究3株表型CAMP陰性株僅1株

cfb

基因陽(yáng)性，2株陰性。這表明CAMP因子的表達(dá)減少或表達(dá)途徑上其他地方的基因缺陷及

cfb

基因缺失均可能導(dǎo)致CAMP試驗(yàn)陰性，已有研究指出影響

cfb

基因的染色體缺失會(huì)導(dǎo)致CAMP試驗(yàn)陰性。本研究中，CAMP試驗(yàn)弱陽(yáng)性的菌株中也存在2株

cfb

基因缺失，可能還存在類似于CAMP促溶血活性的其他蛋白調(diào)節(jié)通路，有待進(jìn)一步研究。有研究建立了一種新的針對(duì)

cfb

基因片段的核酸擴(kuò)增方法，敏感性為95.5%,與本研究92.2%的檢出率較為一致，這與傳統(tǒng)認(rèn)為GBS均含有

cfb

基因的觀點(diǎn)不同。因此，對(duì)于GBS的檢測(cè)CAMP試驗(yàn)與

cfb

基因檢測(cè)均缺乏一定的敏感性，應(yīng)與細(xì)菌培養(yǎng)聯(lián)合檢測(cè)，但是對(duì)于基層醫(yī)院，CAMP試驗(yàn)仍是一種簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。該研究所收集的標(biāo)本僅來自安徽的一所三甲醫(yī)院，后續(xù)宜擴(kuò)大標(biāo)本量進(jìn)行更加深入和廣泛的研究?？傊?，藥敏試驗(yàn)為臨床合理使用抗生素提供參考，該地區(qū)尿液中GBS紅霉素和四環(huán)素耐藥嚴(yán)重，耐藥基因以ermB和tetM為主，臨床上應(yīng)加強(qiáng)對(duì)紅霉素介導(dǎo)的克林霉素耐藥的檢測(cè)，CAMP試驗(yàn)及

cfb

基因陰性值得關(guān)注，防止臨床檢測(cè)漏檢。