馬曉荷，汪敏，朱磊，郭見多，李清越，劉婷，翟杜娟，孫成松，張世清，汪天平

安徽省血吸蟲病防治研究所，安徽 合肥 230601

血吸蟲病是由裂體吸蟲屬吸蟲感染引起的寄生蟲病，該病嚴重危害人類健康,阻礙經(jīng)濟社會發(fā)展,主要分布在非洲、亞洲和拉丁美洲，是全球重要的公共衛(wèi)生問題[1-2]。感染人類的血吸蟲之中，中國只存在日本血吸蟲[1,3]。安徽省日本血吸蟲病流行區(qū)類型以湖沼型為主[4-6]，還包括洲灘型和山丘型。

在地理隔離[7-8]、終宿主差異[9]等因素的影響下，血吸蟲個體會產(chǎn)生遺傳變異。線粒體DNA(mtDNA)是寄生蟲群體遺傳研究中具有較好價值的遺傳標志[10]。單個個體內(nèi)mtDNA有高度均一性，遵循嚴格的母系遺傳方式，具有進化速度快、群體內(nèi)變異大、近緣種間解釋的靈敏度高等特點，利于進行群體遺傳分析。為了解安徽省不同地區(qū)日本血吸蟲群體間的遺傳進化關(guān)系，本文通過測定并分析安徽省不同類型流行區(qū)日本血吸蟲成蟲的線粒體NADH(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)脫氫酶1(ND1)和細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因序列并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，探討安徽省不同類型血吸蟲病流行區(qū)日本血吸蟲群體間的進化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 采集安徽省山丘型流行區(qū)(池州市石臺縣)和湖沼型流行區(qū)(安慶市大觀區(qū)、銅陵市樅陽縣)的釘螺，逸蚴篩選陽性釘螺并繼續(xù)飼養(yǎng)。兩周后對釘螺進行再次逸蚴，收集尾蚴感染BALB/c小鼠(雌性，6～7周)，35天后解剖小鼠，門靜脈灌注法分離和收集成蟲，單只成蟲分別收集于含有95%乙醇的1.5 mL離心管中，-80 ℃保存。

1.2方法

1.2.1日本血吸蟲成蟲DNA提取 每只成蟲用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO44.3 mmol/L，KH2PO41.4 mmol/L)洗滌3次，去除雜質(zhì)和95%乙醇。用DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒(Qiagen，德國)提取DNA，具體操作流程參照說明書，不同地區(qū)的血吸蟲成蟲DNA單獨提取。

1.2.2ND1和COⅠ基因PCR擴增和測序 以GenBank中日本血吸蟲線粒體基因組序列NC_002544.1中COⅠ基因編碼序列和ND1基因編碼序列為模板設(shè)計引物。參考序列COⅠ基因長度為1 527 bp，正向引物5'-GATTTGATATCTTGATTTGTCT-3'，反向引物5'-CTAATACTTTGATCAATTCTTACCG-3'；ND1基因長度為891 bp，正向引物5'-ATGAATATATGAAACTTTTTAG-3'，反向引物5'-CTACCTTATAATTATAATCAATCCG-3'。PCR擴增反應(yīng)體系總體積50 μL，ND1擴增條件:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸8 min；COⅠ擴增條件:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸8 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.3ND1和COⅠ基因克隆和測序 用膠回收試劑盒純化擴增產(chǎn)物，然后將產(chǎn)物連接至pESI-T載體(上海翊圣生物科技有限公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選重組陽性克隆。將鑒定成功的克隆子送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.4序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 利用Chromas軟件查看測序峰圖，手工篩查每條序列的測序結(jié)果。利用Clustal X 2.0[11]比對序列，使用DNAsp 6.0[12]和Mega X[13]分析序列的基本特征。在Mega X中以COⅠ和ND1序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，外群(outgroup)分別為曼氏血吸蟲(Schistosomamansoni)的COⅠ和ND1序列，序列來源為GenBank中曼氏血吸蟲線粒體全基因組序列，序列號為NC_002545.1。建樹方法為鄰接法(Neighbor-Joining Method)，自展值(bootstrap)為1 000，樣本間進化距離計算方法為Kimura 2-parameter 算法。

2 結(jié) 果

2.1ND1和COⅠ基因序列多態(tài)性分析 本研究中所有樣品擴增獲得的條帶大小均與預(yù)期一致，截去首尾部分序列后用于分析的ND1和COⅠ基因序列長度分別為844 bp和1 481 bp。ND1基因序列存在15個變異位點，G+C含量為0.298，堿基轉(zhuǎn)換數(shù)為3，沒有發(fā)生堿基顛換；COⅠ序列存在74個變異位點，G+C含量為0.326，堿基轉(zhuǎn)換數(shù)為21，堿基顛換數(shù)為5。與ND1基因相比，COⅠ基因序列的突變位點較多，堿基替換種類中不僅存在堿基轉(zhuǎn)換還存在堿基顛換。樣本的COⅠ序列核苷酸多樣性(Pi)為0.017 3，高于ND1(0.004 7)，綜合其他數(shù)據(jù)可見所研究地區(qū)日本血吸蟲的COⅠ基因比ND1基因具有更高的序列多樣性。見表1。

表1 安徽省日本血吸蟲線粒體ND1和COⅠ基因序列的基本特征

對不同地區(qū)血吸蟲序列進行比較發(fā)現(xiàn)，來自湖沼型流行區(qū)的日本血吸蟲樣本ND1的基因變異位點數(shù)、核苷酸多樣性(Pi)、單倍型個數(shù)和單倍型多樣性(Haplotype diversity，Hd)均高于來自山丘型流行區(qū)的樣本。來自湖沼型流行區(qū)的日本血吸蟲樣本COⅠ序列的變異位點數(shù)、核苷酸多樣性也明顯高于來自山丘型流行區(qū)的樣本。見表2。

表2 安徽省不同地區(qū)日本血吸蟲線粒體ND1和COⅠ基因序列比較

2.2不同地區(qū)日本血吸蟲種群間遺傳距離和進化分析 不同地區(qū)日本血吸蟲成蟲的ND1和COⅠ基因序列均存在略微差異。來自山丘型流行區(qū)與兩處來自湖沼型流行區(qū)的日本血吸蟲樣本之間，ND1序列遺傳距離分別為0.004 8和0.003 3；COⅠ序列遺傳距離均為0.035。兩處來自湖沼型流行區(qū)的日本血吸蟲樣本之間ND1和COⅠ序列遺傳距離為0.001 8和0.007。

依據(jù)COⅠ 和ND1序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示，來自山丘型流行區(qū)和湖沼型流行區(qū)的日本血吸蟲樣本ND1序列沒有較大的差異，見圖1A。而COⅠ序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中，來自山丘型流行區(qū)的日本血吸蟲樣本單獨成簇，且Bootstrap值為100%，說明和來自湖沼型流行區(qū)的日本血吸蟲樣本相比，來自山丘型流行區(qū)的日本血吸蟲樣本COⅠ基因序列發(fā)生了一定程度的變化，見圖1B。

注：A為基于ND1序列的系統(tǒng)進化樹，B為基于COⅠ序列的系統(tǒng)進化樹，枝上數(shù)字為bootstrap 百分比。ST為來自山丘型流行區(qū)的樣本，ZY和DG為來自兩處湖沼型流行區(qū)的樣本。

3 討 論

日本血吸蟲病流行區(qū)類型主要分為湖沼型流行區(qū)、洲灘型和山丘型。本研究選擇了來自安徽省三個縣(區(qū))、兩種流行區(qū)的日本血吸蟲樣本，對兩個線粒體基因片段進行序列分析，從而初步探討不同地區(qū)日本血吸蟲群體的線粒體基因差異。從不同地區(qū)的縱向比較來看，無論是ND1基因還是COⅠ基因，湖沼型流行區(qū)樣本的變異位點數(shù)、核苷酸多樣性(Pi)、核苷酸差異平均數(shù)明顯高于山丘型流行區(qū)。這可能是因為山丘型流行區(qū)環(huán)境相對封閉和保守，其間的生物群體發(fā)生基因交流的機會較少，發(fā)生的頻率也更低，因此種群相對穩(wěn)定；而湖沼型、水網(wǎng)型地區(qū)，水域面積廣闊，加之不時爆發(fā)的夏季洪水，這些流行區(qū)的釘螺隨水流遷移更頻繁，導致日本血吸蟲基因交流也更頻繁。

日本血吸蟲在中國分布的種系研究顯示，不同地域的日本血吸蟲在基因、表型、流行特征等方面不完全相同，學者認為可將其分為不同的地域株[14-16]。邱持平[14]研究發(fā)現(xiàn)湖南、安徽、湖北、四川及江蘇的日本血吸蟲株ND1基因和COⅠ基因存在兩種基因型。郭凱文[15]依據(jù)線粒體COⅠ 和ND1基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示中國大陸日本血吸蟲分為三類：中國山區(qū)型地域株、湖沼江灘型地域株、湖北地域株。安徽省日本血吸蟲病流行區(qū)以湖沼型為主，兼有水網(wǎng)型和山丘型。池州市石臺縣是安徽省內(nèi)典型的山丘型血吸蟲病流行區(qū)。石臺地區(qū)的日本血吸蟲具有和其他地區(qū)日本血吸蟲不同的生物學特性，其主要保蟲宿主是野鼠[17-18]，且當?shù)馗腥拘葬斅菥哂幸归g逸蚴的習性[19-20]。本研究首次依據(jù)線粒體COⅠ和ND1基因?qū)κ_地區(qū)日本血吸蟲群體進行遺傳進化研究，結(jié)果表明石臺縣日本血吸蟲群體的COⅠ基因與樅陽縣、大觀區(qū)的樣本之間具有一定的差異，而ND1基因沒有發(fā)生明顯的變化。依據(jù)本研究結(jié)果，盡管石臺山區(qū)的日本血吸蟲出現(xiàn)了流行病學和生物學上的差異，但是基因水平差異還尚不明顯。這可能是因為三地均位于安徽省內(nèi)，且三者之間地理位置較近。

本研究結(jié)果初步表明安徽省石臺縣山丘型日本血吸蟲病流行區(qū)的日本血吸蟲在線粒體基因水平與湖沼型流行區(qū)(安慶市大觀區(qū)、銅陵市樅陽縣)的日本血吸蟲具有一定差異?；谑_縣日本血吸蟲保蟲宿主和夜間逸蚴習性的特殊性，其基因差異是否會影響其對小鼠或者家兔的感染性和致病性等還有待進一步研究。