孫 策， 苗晶晶??， 李 莉， 潘魯青

(1. 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))， 山東 青島 266003； 2. 山東省海洋生物研究院, 山東 青島 266104)

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥(Synthetic pyrethroid insecticides，SPIs)是一類以文菊花中的天然成分除蟲菊酯合成的仿生農(nóng)藥，其基本結(jié)構(gòu)是具有苯氧基的環(huán)丙烷酯[1]，具有高效廣譜，對(duì)哺乳動(dòng)物低毒和低殘留的優(yōu)點(diǎn)[2]。它是繼有機(jī)氯、有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯之后的第三代農(nóng)藥，在農(nóng)業(yè)中得到了廣泛的重視[3]。2016年SPIs的全球銷售額為16.33億美元，是全球三大類殺蟲劑之一[4]。目前我國殺蟲劑用量分別占農(nóng)藥總用量的42%，其中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥占?xì)⑾x劑市場的30%以上[5]，已成為有機(jī)磷、有機(jī)氯殺蟲劑的重要取代類型[6]。由于SPIs為非離子型農(nóng)藥，具有高有機(jī)碳吸附系數(shù)、弱極性以及親酯疏水性，使得其難溶于水，而易與土壤顆粒結(jié)合，從而在沉積物中積累[7]。近年來SPIs也被引入水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于防治寄生蟲及其敵害生物等，對(duì)近海灘涂貝類養(yǎng)殖和生態(tài)環(huán)境造成潛在威脅。

為保護(hù)某一生境中更多的物種，可以采用物種敏感性分布(Species sensitivity distribution, SSD)對(duì)SPIs造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。其基本方法是收集多種水生生物的毒性數(shù)據(jù)，并構(gòu)建劑量-效應(yīng)的累計(jì)概率模型，即可得到SSD曲線，在SSD曲線上與累積概率5%對(duì)應(yīng)的濃度，即為對(duì)5%的水生生物產(chǎn)生危害的濃度HC5，該數(shù)值涵義為可保護(hù)95%的水生生物的毒物濃度標(biāo)準(zhǔn)[8]。

近海貝類分布廣泛且具有重要的生態(tài)學(xué)意義，因而已被廣泛用作海洋和河口污染的指示生物[9]。毛蚶(Scapharcasubcrenata)在中國北起鴨綠江，南至廣西均有分布，被廣泛養(yǎng)殖和食用，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[10]。SPIs入海后可能會(huì)對(duì)貝類產(chǎn)生毒性危害并影響近海生態(tài)環(huán)境。因此，本實(shí)驗(yàn)開展了甲氰菊酯、氯氰菊酯和溴氰菊酯3種SPIs對(duì)毛蚶成貝及幼貝的急性毒性效應(yīng)研究，并結(jié)合其它水生生物數(shù)據(jù)擬合了SSD曲線，旨在補(bǔ)充SPIs對(duì)海洋生物的毒性數(shù)據(jù)庫，為其它毒理實(shí)驗(yàn)和海洋生態(tài)環(huán)境的相關(guān)評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 受試生物

毛蚶幼貝(殼長(2.67±0.15)mm，殼高(1.64±0.11) mm)取自山東省海洋生物研究院，成貝(殼長(4.10±0.28) cm，殼高(3.10±0.30) cm，殼寬(2.20±0.30) cm)取自青島市南山水產(chǎn)品市場。貝類取回后，將雜質(zhì)和破損、死亡的個(gè)體撿出。于自然海水中暫養(yǎng)一周，自然海水取自青島太平角海域，暫養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)過程中海水溫度為(23.5±1.5) ℃，pH為8.0±0.2，溶解氧為(6.3 ±1.0) mg·L-1，鹽度為30.5±0.7。每日更換新水100%，不投餌，少量充氧，每日光暗比為18∶6。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥劑

二甲基亞砜(≥99.5%)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司生產(chǎn)，作助溶劑使用；20%甲氰菊酯乳油，購自浙江威爾達(dá)化工有限公司；25 g·L-1溴氰菊酯乳油，購自拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司；100 g·L-1氯氰菊酯乳油，購自巴斯夫上海有限公司。使用時(shí)先將3種SPIs用二甲基亞砜稀釋至實(shí)驗(yàn)濃度，且二甲基亞砜體積不超過實(shí)驗(yàn)海水體積的0.01%。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步確定3種SPIs對(duì)毛蚶幼貝及成貝的96 h致死濃度范圍后，按照一定的幾何級(jí)數(shù)分別設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，以及一個(gè)自然海水對(duì)照組和0.01%海水體積的二甲基亞砜對(duì)照組。挑選規(guī)格均勻、健康的毛蚶作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行投放10只個(gè)體。實(shí)驗(yàn)期間不投餌，采用半靜水式養(yǎng)殖方法，每24 h換水100%并重新投藥，不間斷微量充氧，于24、48、72和96 h分別記錄各組毛蚶死亡數(shù)并在記錄后及時(shí)將死貝挑出。毛蚶幼貝死亡判斷：輕輕搖晃容器，存活毛蚶會(huì)伸出足附著于容器底部不隨水晃動(dòng)，將隨水晃動(dòng)的毛蚶取出，單獨(dú)放入一旁自然海水中，觀察5 min后，仍無任何活動(dòng)的毛蚶即判定為死亡。毛蚶成貝死亡判斷：用鑷子觸碰其兩殼縫隙，死亡貝類的雙殼會(huì)有所松動(dòng)，活的貝類雙殼則依然緊閉。

1.4 毒理數(shù)據(jù)來源及篩選原則

毒理數(shù)據(jù)主要來自美國EPA的ECOTOX(https://cfpub.epa.gov/ecotox/)數(shù)據(jù)庫、Web of Science(http://apps.webofknowledge.com/) 、中國知網(wǎng)(http://www.cnki.net/)和本研究中獲得的結(jié)果(選取毛蚶幼貝實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。選取急性毒性實(shí)驗(yàn)的半數(shù)致死濃度(LC50)作為評(píng)估終點(diǎn)，暴露時(shí)間為24～96 h。全部所采用水生物種分為溞類、橈足類(暴露時(shí)間選擇48 h)；魚、蝦、貝、蟹(暴露時(shí)間選擇96 h)等。對(duì)于同一物種相同暴露時(shí)間存在多個(gè)可用數(shù)據(jù)，采用毒性值濃度的幾何平均值作為毒理數(shù)據(jù)，而毒性值差異超過一個(gè)數(shù)量級(jí)的，舍棄離群值數(shù)據(jù)[11]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果取三次平行的平均值，利用SPSS 25.0 中的濃度對(duì)數(shù)-概率回歸方程計(jì)算96 h的濃度對(duì)數(shù)的回歸方程，LC50及其95%置信區(qū)間。SSD曲線擬合采用ETX 2.0軟件以濃度為橫軸，累計(jì)概率為縱軸建立坐標(biāo)系，應(yīng)用蒙特卡羅算法構(gòu)建SSD曲線并計(jì)算HC5值。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 甲氰菊酯對(duì)毛蚶幼貝和成貝急性毒性效應(yīng)及物種敏感度分布

急性毒性實(shí)驗(yàn)過程中自然海水和二甲基亞砜對(duì)照組中貝類的死亡率均為0。本研究中甲氰菊酯對(duì)毛蚶幼貝以及成貝的96 h LC50值分別為286.5和3 931.9 ng·mL-1(見表1)。成貝96 h LC50值約為幼貝的14倍。在所有時(shí)間段內(nèi)(24、48、72和96 h)，幼貝死亡率均呈現(xiàn)顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系，而成貝中除24 h時(shí)，也均呈現(xiàn)顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系。隨著時(shí)間的延長，幼貝死亡率基本沒有變化，而成貝死亡率隨時(shí)間有顯著增加。

表1 3種菊酯類農(nóng)藥對(duì)毛蚶幼貝和成貝的 96 h LC50Table 1 96 h LC50 values of three synthetic pyrethroid insecticides on juvenile and adult Scapharca subcrenata

由表2和圖1可知：甲氰菊酯對(duì)水生生物的急性毒性測定值范圍為0.27～286.59 ng·mL-1，HC5值為0.20 ng·mL-1。對(duì)甲氰菊酯最為敏感的水生生物為斑馬魚(Brachydaniorerio)，其次為糠蝦(Americamysisbahia)、招潮蟹(Ucapugilator)，然后依次為其它9種魚類的敏感性相近，本研究中受試毛蚶幼貝的敏感性最低。毛蚶幼貝對(duì)甲氰菊酯敏感性最低，魚類與蝦蟹類對(duì)甲氰菊酯敏感性相近，但因?yàn)槲r蟹類數(shù)據(jù)量較少，不確定性較大，在今后的研究中可補(bǔ)充相關(guān)數(shù)據(jù)，增強(qiáng)SSD曲線的可靠性。

表 2 甲氰菊酯對(duì)水生生物的急性毒性數(shù)據(jù)Table 2 Acute toxicity data of fenpropathrin to aquatic organisms

(三角標(biāo)記代表毛蚶數(shù)據(jù)。Datum of S. subcrenata was presented by triangle.)圖1 甲氰菊酯的水生生物物種敏感度分布曲線Fig. 1 Sensitivity distribution curve of aquatic species for fenpropathrin

2.2 溴氰菊酯對(duì)毛蚶幼貝和成貝急性毒性效應(yīng)及物種敏感度分布

本研究中溴氰菊酯對(duì)毛蚶幼貝以及成貝的96 h LC50值分別為23.3和709.5 ng·mL-1(見表2)，成貝是幼貝的30.34倍。急性毒性實(shí)驗(yàn)過程中，24 h時(shí)，幼貝所有濃度組均已出現(xiàn)死亡個(gè)體，最高死亡率為36.7%；在成貝中，最低濃度組未出現(xiàn)死亡個(gè)體，最高死亡率為最高濃度組的26.7%。只有在96 h時(shí)，成貝和幼貝中死亡率與濃度成正比。隨時(shí)間延長，幼貝和成貝中死亡率均逐漸上升。

由表3和圖2可知：溴氰菊酯對(duì)水生生物的急性毒性測定值范圍為0.11～790.00 ng·mL-1，HC5值為0.01 ng·mL-1。對(duì)溴氰菊酯最為敏感的水生生物為遠(yuǎn)海梭子蟹(Portunuspelagicus)，其次為多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)和日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)。最不敏感的水生生物為鉤蝦(Hyallelaazteca)，其次為文蛤(Meretrixmeretrix)和本研究中的毛蚶幼貝?？傮w而言，雙殼貝類對(duì)溴氰菊酯敏感性最低，其次分別為魚類、蝦蟹類，多毛類和溞類的數(shù)據(jù)量較少，因此未作比較。

(三角標(biāo)記代表毛蚶數(shù)據(jù)。Datum of S. subcrenata was presented by triangle.)圖2 溴氰菊酯的水生生物物種敏感度分布曲線Fig. 2 Sensitivity distribution curve of aquatic species for deltamethrin

表3 溴氰菊酯對(duì)水生生物的急性毒性數(shù)據(jù)Table 3 Acute toxicity data of deltamethrin to aquatic organisms

2.3 氯氰菊酯對(duì)毛蚶幼貝和成貝急性毒性效應(yīng)及物種敏感度分布

本研究中氯氰菊酯對(duì)毛蚶幼貝以及成貝的96 h LC50值分別為17.9和737.7 ng·mL-1(見表1)，成貝是幼貝的41倍。急性毒性實(shí)驗(yàn)過程中，24 h時(shí)，幼貝所有濃度組均已出現(xiàn)死亡個(gè)體，最高死亡率為最高濃度組的66.7 %；在成貝中，最低濃度組未出現(xiàn)死亡個(gè)體，最高死亡率僅為13.3 %(2 000 ng·mL-1組)。在96 h時(shí)，幼貝死亡率與濃度成正比；72和96 h時(shí)，成貝的死亡率與濃度成正比。隨時(shí)間延長，幼貝和成貝中死亡率均逐漸上升。

由表4和圖3可知：氯氰菊酯對(duì)水生生物的急性毒性測定值范圍為0.14～380.00 ng·mL-1，HC5值為 0.02 ng·mL-1。對(duì)氯氰菊酯最為敏感的水生生物為擬長腹劍水蚤(Oithonasimilis)，其次為紅螯鰲蝦(Procambarusclarkii)和美洲龍紋鰲蝦(Procambarusvirginalis)。最不敏感的水生生物為鉤蝦，其次為櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)和本研究中的毛蚶幼貝?？傮w而言，雙殼貝類對(duì)氯氰菊酯敏感性最低，其次分別為魚類、橈足類和蝦蟹類。

表4 氯氰菊酯對(duì)水生生物的急性毒性數(shù)據(jù)Table 4 Acute toxicity data of cypermethrin to aquatic organisms

(三角標(biāo)記代表毛蚶數(shù)據(jù)。Datum of S. subcrenata was presented by triangle.)圖3 氯氰菊酯的水生生物物種敏感度分布曲線Fig.3 Sensitivity distribution curve of aquatic species for cypermethrin

3 討論

研究表明，SPIs主要通過干擾神經(jīng)膜上的鈉通道而造成神經(jīng)毒性，除此之外，SPIs還被證明具有多種類型的毒性，如生殖發(fā)育毒性、免疫毒性和代謝毒性等。且由于其具有親脂性，在水中易于進(jìn)入水生動(dòng)物的鰓和血液，因此對(duì)水生生物的毒性要遠(yuǎn)高于哺乳動(dòng)物。根據(jù)《新化學(xué)物質(zhì)危害評(píng)估導(dǎo)則(HJ/T154-2004)》的毒性評(píng)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，本研究中的3種SPIs對(duì)水生生物毒性值(0.11～790.00 ng·mL-1)均為劇毒級(jí)別(小于等于5 mg·kg-1)[12]。目前，對(duì)于SPIs對(duì)水生生物毒性的研究，Sayeed等使用0.75 ng·mL-1溴氰菊酯處理藍(lán)點(diǎn)石斑魚(ChannapunctatusBloch)，可誘導(dǎo)其腎臟和肝臟中各種抗氧化酶和非酶類抗氧化劑的產(chǎn)生，表明溴氰菊酯對(duì)其具有明顯的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)作用[13]。彭芳等使用0.10 ng·mL-1溴氰菊酯處理多刺裸腹溞 24 h 后, 谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)活力較對(duì)照組顯著降低(P<0.05), 表明代謝產(chǎn)生的活性氧(ROS)等氧化物質(zhì)已不能被機(jī)體及時(shí)清除, 其累積毒性嚴(yán)重抑制了GST的功能和合成, 裸腹溞解毒代謝功能明顯下降[14]。譚曉珍等用濃度范圍為0.10～3.98 mg·L-1甲氰菊酯染毒櫛孔扇貝，發(fā)現(xiàn)甲氰菊酯會(huì)引起ATP酶的超?；顒?dòng)[15]。Singh等用0.02 mg·L-1氯氰菊酯對(duì)印度囊鰓鲇(Heteropneustesfossilis)進(jìn)行為期45 d的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯可通過下丘腦-垂體-性腺軸影響類固醇生成，從而引起內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，并導(dǎo)致精子活力下降[16]。本研究得到的毛蚶成貝和幼貝的急性毒性數(shù)據(jù)可以為亞慢性、慢性及其他毒理實(shí)驗(yàn)接觸劑量和觀察指標(biāo)的選擇提供參考依據(jù)。

由表1可知，3種SPIs中，甲氰菊酯對(duì)毛蚶成貝和幼貝的毒性最低，溴氰菊酯和氯氰菊酯的毒性較高且相近。在毛蚶幼貝中，甲氰菊酯的LC50分別是溴氰菊酯和氯氰菊酯的12和16倍；在毛蚶成貝中，甲氰菊酯的LC50分別是溴氰菊酯和氯氰菊酯的6和5倍。不同SPIs種類之間毒性存在較大差異。趙玉琴等研究了SPIs對(duì)7種魚類的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明魚類中各SPIs的LC50：溴氰菊酯<甲氰菊酯<氯氰菊酯[17]，這與本研究的結(jié)果不同，可能是因?yàn)镾PIs對(duì)不同物種的毒性效應(yīng)有所差異。3種SPIs對(duì)毛蚶成貝的毒性均遠(yuǎn)低于對(duì)幼貝的毒性，毛蚶成貝中甲氰菊酯、溴氰菊酯和氯氰菊酯的LC50分別是幼貝中14、30和41倍。陳堅(jiān)等[18]研究了氨氮和硫化物對(duì)文蛤幼貝和成貝存活的影響，得到其96 h半致死濃度分別為36.0 mg·L-1(幼貝)、150.6 mg·L-1(成貝)和16.2 mg·L-1(幼貝)、138.4 mg·L-1(成貝)。幼體對(duì)污染物的耐受性均沒有成體高，這與本研究所得結(jié)果一致。

通過表2、3、4和圖1、2、3可知，雙殼貝類對(duì)3種SPIs敏感性最低，且雙殼貝類對(duì)SPIs的敏感性有物種差異。魚類與蝦蟹類對(duì)SPIs敏感性相近且較高，其它水生生物普遍對(duì)SPIs的敏感性較高，但因?yàn)閿?shù)據(jù)量較少，不確定性較大，在今后的研究中可補(bǔ)充相關(guān)數(shù)據(jù)，增強(qiáng)SSD曲線的可靠性。由于雙殼貝類對(duì)這些農(nóng)藥的敏感性比較低，從而導(dǎo)致其易在雙殼貝類體內(nèi)富集，特別是可食用的物種會(huì)直接對(duì)人體的健康產(chǎn)生影響，因此后續(xù)可開展相關(guān)物種體內(nèi)SPIs富集情況和對(duì)人體安全評(píng)估的研究工作。

甲氰菊酯、溴氰菊酯和氯氰菊酯的HC5值分別為0.20、0.01 和0.02 ng·mL-1。水生生物對(duì)溴氰菊酯的敏感性最高，而對(duì)甲氰菊酯的敏感性最低。徐瑞祥和陳亞華構(gòu)建了4種常用有機(jī)磷農(nóng)藥(二嗪磷、對(duì)硫磷、殺螟硫磷和馬拉硫磷)對(duì)淡水生物的SSD曲線，計(jì)算了4種有機(jī)磷農(nóng)藥的HC5值分別為0.15、0.77、0.29和2.54 ng·mL-1[19]。除二嗪磷HC5值低于甲氰菊酯外，其余有機(jī)磷農(nóng)藥HC5值均高于SPIs，說明水生生物對(duì)SPIs的敏感性總體高于有機(jī)磷農(nóng)藥。目前，關(guān)于SPIs的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中，僅在《地表水環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)(GB 3838—2002)》中規(guī)定溴氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)限量為0.02 mg·L-1, 這一標(biāo)準(zhǔn)遠(yuǎn)高于溴氰菊酯的HC5值(0.01 ng·mL-1)，會(huì)對(duì)水生生物造成影響，而SPIs的其他相關(guān)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)也有待補(bǔ)充。