謝美娟，滕聰聰，龍 嵐，劉永幸，陳新超，張 杰

(1.昆明理工大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650031；2.盈江縣婦幼保健院 院長辦公室，云南 盈江 679300；3.云南省第一人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)遺傳科，云南 昆明 650032)

地中海貧血(thalassemia, 簡稱地貧)是一種以嚴(yán)重貧血、骨骼變形、肝脾腫大等為主要臨床表現(xiàn)的疾病，因其首次在地中海地區(qū)發(fā)現(xiàn)所以命名為地中海貧血。地貧是一組常染色體隱性遺傳導(dǎo)致的單基因遺傳病，是由于珠蛋白鏈合成異常導(dǎo)致溶血性貧血，會(huì)出現(xiàn)各種相應(yīng)的臨床表現(xiàn)[1-2]。

地貧在中國南方較為高發(fā)，尤其是云南[3]、廣西[4]、海南[5]、廣東[6]等省份。地貧的分布具有明顯的多樣性和遺傳異質(zhì)性，不同地區(qū)地貧突變類型不同。云南省民族眾多，已經(jīng)發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示，傣族地貧的發(fā)病率較高。本課題組于2016年對(duì)西雙版納等地區(qū)傣族人群進(jìn)行珠蛋白基因二代測序，地貧檢出率高達(dá)49.5%[7]。此外，其他研究也表明，壯族、景頗族、阿昌族、德昂族檢出率也較高[8]。不同種族群體中地貧突變率的地理分布存在明顯差異，云南省南部尤為高發(fā)。盈江縣地處云南省西南部為傣族、阿昌族的聚居地，與緬甸等地貧高發(fā)的國家相鄰。為了解盈江縣傣族地貧流行病學(xué)現(xiàn)狀，本研究對(duì)云南省德宏州盈江縣400例傣族育齡人群進(jìn)行血液學(xué)及地貧基因相關(guān)檢測，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對(duì)象：收集2019年至2020年云南省德宏州盈江縣傣族育齡人群，共400例，年齡為18～47歲，受檢者均為盈江縣籍貫居民、相互之間無親緣關(guān)系。根據(jù)知情同意的原則，抽取外周靜脈血樣3 mL。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(編號(hào)：2018GJ108)。在樣本采集前，受試者均簽署知情同意書。

1.1.2 儀器與試劑：Sysmex XE-5000全自動(dòng)血液分析儀及其配套試劑(TOSOH公司)；Capillarys 2全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀及配套試劑(Sebia公司)；天隆NP968核酸提取儀及其配套試劑(西安天隆科技有限公司)；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司)；MGISEQ-2000基因測序儀(華大智造科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 血常規(guī)檢測：用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測血紅蛋白(hemoglobin, HGB)、紅細(xì)胞平均容積(mean corpuscular volume, MCV)和紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(mean corpsular hemoglobin，MCH)。

1.2.2 血紅蛋白電泳：使用毛細(xì)管血紅蛋白電泳對(duì)血樣進(jìn)行血紅蛋白分析。主要檢測血紅蛋白A(hemoglobin A, Hb A)、血紅蛋白A2(hemoglobin A2, Hb A2)、血紅蛋白F(hemoglobin F, Hb F)以及異常條帶。

1.2.3 二代測序(next generation sequencing, NGS)：使用天隆NP968核酸提取儀及其配套試劑從200 μL血液樣本中提取基因組DNA。將DNA提取物排列在96孔板中，并通過NanoDrop 2000定量濃度。將分析限制在DNA濃度>20 ng/μL，A260/A280比值在1.8和2.0之間的樣品。設(shè)計(jì)特異性引物用于地貧相關(guān)基因HBA1、HBA2、HBB的擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物按照文庫制備方案進(jìn)行文庫構(gòu)建，包括PCR-pooling產(chǎn)物純化、超聲打斷、打斷后純化、末端修復(fù)、末端修復(fù)后純化、加“A”、 加“A”后純化、接頭連接、片段分選，根據(jù)片段大小分選文庫A、文庫B，使用MGISEQ-2000上機(jī)進(jìn)行結(jié)果分析[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基因攜帶率

在受檢的400例人群中，共檢出219例地貧基因的攜帶者，地貧基因的攜帶率為54.75%(219/400)。其中α-地貧基因型以-α3.7最為常見，β-地貧基因型以CD26 (G>A)最為常見。根據(jù)基因類型分述如下(表1)。

表1 地貧病例中的基因突變類型及分布Table 1 Types and distribution of gene mutations in thalassaemia cases

2.1.1 α-地貧的基因突變類型及攜帶率：共檢出α-地貧基因攜帶者133例，人群攜帶率為33.25%(133/400)。共檢出6種等位基因，分別是-α3.7、--SEA、αCSα、αWSα、Hb Hekinan Ⅱ (HbA1:c.84G>T)、-α4.2。

2.1.2 β-地貧的基因突變類型及攜帶率：共檢出β-地貧基因攜帶者47例，人群攜帶率為11.75%(47/400)。共檢出4種基因突變類型，分別是CD26 (G>A)、CD17 (A>T)、CD41-42 (-TTCT)、IVS-I-1 (G>A)。

2.1.3 α復(fù)合β地貧突變類型及攜帶率：共檢出α復(fù)合β地貧基因攜帶者39例，人群攜帶率為9.73%(39/400)，占檢出地中海貧血的17.81%(39/219)。

2.2 血液學(xué)參數(shù)分析

2.2.1 α-地貧血液學(xué)和電泳特征：各種α-地貧血液學(xué)特征進(jìn)行組間獨(dú)立性樣本t檢驗(yàn)，--SEA突變類型的MCH相對(duì)較低，αCSα突變類型的Hb A2相對(duì)較低(表2)。

表2 α-地貧血液學(xué)參數(shù)的變化Table 2 Changes in hematological parameters of α-thalassaemia

2.2.2 β-地貧血液學(xué)和電泳特征：對(duì)于對(duì)β-地貧的血液學(xué)特征進(jìn)行組間獨(dú)立性樣本t檢驗(yàn)，CD17 (A>T)的MCV相對(duì)較低(表3)。

表3 β-地貧血液學(xué)參數(shù)的變化Table 3 Changes in hematological parameters of β-thalassemia

2.2.3 α復(fù)合β地貧血液學(xué)和電泳特征：α復(fù)合β地貧的血常規(guī)參數(shù)和血紅蛋白電泳結(jié)果與單純的β地貧基因攜帶者無差異(表4)。

表4 αβ-地貧血液學(xué)參數(shù)的變化Table 4 Changes in hematological parameters of composite α and β thalassemia

3 討論

地貧是一種會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重貧血的疾病，目前還沒有有效的治療方法。由于地貧基因攜帶者通常無明顯的臨床癥狀，會(huì)導(dǎo)致醫(yī)務(wù)人員漏診，以致中重度地貧患兒的出生。傣族人群為地貧高發(fā)人群，因此對(duì)云南省德宏州盈江縣傣族人群進(jìn)行地貧流行病學(xué)調(diào)查具有一定的意義。

本研究檢測的樣本數(shù)為400例，確診地貧的有219例，人群地貧基因攜帶率為54.74%(219/400)，提示盈江縣為地貧較為高發(fā)的地區(qū)。α-地貧最為常見的類型為-α3.7，其次是--SEA，這與之前對(duì)云南德宏[9]報(bào)道一致。本研究中的-α3.7突變型表現(xiàn)為靜止型攜帶者，不出現(xiàn)明顯臨床癥狀；--SEA突變類型中MVC、MCH偏低，提示其可能會(huì)導(dǎo)致輕度貧血，該兩種突變類型與之前的報(bào)道吻合[10-11]。αCSα臨床上可表現(xiàn)為靜止型攜帶者或者輕度貧血，αWSα雜合子通常為靜止型攜帶者，本研究中這兩類突變類型的血液學(xué)特征也與之前的報(bào)道一致[12-13]。本研究檢出2例Hb Hekinan Ⅱ (Hb A1:c.84G>T)突變，其表現(xiàn)為無癥狀。該種突變的特征為α1鏈的第27個(gè)氨基酸位置處的谷氨酸被天冬氨酸代替，首次發(fā)現(xiàn)于一個(gè)46歲的日本男性，未引起蛋白結(jié)構(gòu)明顯的變化，攜帶者雜合突變多為無癥狀[14]。

β-地貧中CD26 (G>A)構(gòu)成比最高，CD26(G>A)雜合子表型為輕型貧血或無癥狀攜帶者。此外本研究檢出33例CD26 (G>A)復(fù)合α地貧，均未出現(xiàn)明顯貧血癥狀。CD26 (G>A)純合突變或者CD26 (G>A)/β0雙重雜合突變可能會(huì)表現(xiàn)出較重的臨床癥狀，需輸血治療，是云南省最常見的中重度β地貧的原因之一[15]。

在云南少數(shù)民族地區(qū)進(jìn)行地貧系統(tǒng)性分子流行病學(xué)的調(diào)查，開展孕前婚前檢查，能夠減少地貧基因攜帶者生育中重度地貧患兒，提高人民健康水平，減少疾病負(fù)擔(dān)。本研究對(duì)云南德宏州盈江縣傣族育齡人群進(jìn)行地貧流行病學(xué)的調(diào)查研究，為該地區(qū)地貧遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷提供了臨床數(shù)據(jù)，為今后進(jìn)行有效地地貧防控奠定了一定基礎(chǔ)。