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      腦和脊髓動(dòng)靜脈畸形血管中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異

      2021-11-12 01:47:10王乃利仇文穎
      基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床 2021年11期
      關(guān)鍵詞:胞外基質(zhì)脊髓線(xiàn)粒體

      王乃利,孟 姝,仇文穎,王 霞

      (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 1.人體解剖與組織胚胎學(xué)系;2.免疫學(xué)系,北京 100005)

      動(dòng)靜脈畸形(arteriovenous malformation,AVM)是一類(lèi)動(dòng)靜脈血管間異常連接的罕見(jiàn)血管疾病,易破裂出血,是患者致殘的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。常發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng),包括腦動(dòng)靜脈畸形(brain AVM,bAVM)和脊髓動(dòng)靜脈畸形(spinal AVM,sAVM)[1]。

      對(duì)AVM發(fā)病機(jī)制的研究多集中于bAVM, 如血管形成異常,包括血管生成抑制基因 miR-137和miR-195*表達(dá)降低[2]、Sox2(transcription factor SOX-2,轉(zhuǎn)錄因子SOX-2)-JMJD5(bifunctional peptidase and arginyl-hydroxylase JMJD5,雙功能肽酶和精氨酸羥化酶)作用引起內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition,End-MT)[3],細(xì)胞間通訊異常[4]。在sAVM發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)和血管形成相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)量異常[5]。

      此外,在bAVM和sAVM中均發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的富集[6]、及KRAS(GTPase KRas,GTP酶)/BRAF(serine/threonine-protein kinase B-raf,絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶)突變[1]誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞MAPK-ERK(mitogen-activated protein kinase,絲裂原活化蛋白激酶)通路激活[7]。尚無(wú)報(bào)道兩種疾病間的分子表達(dá)特異性。對(duì)比bAVM和sAVM的蛋白質(zhì)表達(dá)差異,對(duì)深入研究bAVM和sAVM的分子機(jī)制,開(kāi)發(fā)疾病特異性的診斷或治療方法具有重要指導(dǎo)意義。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      1.1.1 材料: 患者bAVM標(biāo)本(4例)和sAVM標(biāo)本(4例)來(lái)自于清華長(zhǎng)庚醫(yī)院,對(duì)照組腦血管(4例)和脊髓血管(4例)來(lái)自于國(guó)家發(fā)育和功能人腦組織庫(kù),對(duì)照組捐獻(xiàn)者無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)和血管系統(tǒng)相關(guān)疾病。標(biāo)本詳細(xì)信息參見(jiàn)表1。所有標(biāo)本于-80 ℃保存。本研究已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理委員會(huì)審核(倫理批準(zhǔn)號(hào):2018008)。經(jīng)患者知情同意。

      表1 入組患者基本信息Tabel 1 Patient’s information

      1.1.2 試劑:尿素(urea)、二硫蘇糖醇和碘乙酰胺來(lái)自于GE Healthcare公司;蛋白酶抑制劑cocktail來(lái)自于Roche公司;Tandem Mass TagTM(TMT)試劑、PBS、甲酸、乙腈、蛋白marker(Thermo Scientific公司);Trypsin/Lys-C(Promega公司);三乙基碳酸氫銨溶液、羥胺、考馬斯亮藍(lán)染液(Sigma-Aldrich公司)。

      1.2 方法

      1.2.1 組織蛋白的提取:在冷PBS中去除組織中血污染,去除bAVM標(biāo)本中黏連的腦組織。標(biāo)本在液氮中迅速冷凍并研磨成粉,加入冷組織裂解液(8 mol/L urea的PBS溶液,含蛋白酶抑制劑cocktail),4 ℃裂解40 min,12 000×g離心10 min取上清即為組織蛋白提取液。使用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

      1.2.2 蛋白質(zhì)的還原、烷基化和TMT標(biāo)記: 組內(nèi)按等質(zhì)量混合各樣本蛋白質(zhì),制備混合蛋白液。每組取100 μg上述蛋白液,加入10 mmol/L二硫蘇糖醇,37 ℃反應(yīng)1 h,然后加入25 mmol/L 碘乙酰胺,室溫反應(yīng)1 h。加入Trypsin/Lys-C 37 ℃反應(yīng)過(guò)夜,將蛋白酶解成肽段。脫鹽后,0.2 mol/L三乙基碳酸氫銨溶液溶解肽段,各組加入0.8 mg TMT試劑室溫標(biāo)記1 h:TMT-126標(biāo)記bAVM,TMT-128標(biāo)記對(duì)照腦血管,TMT-129標(biāo)記sAVM,TMT-131標(biāo)記對(duì)照脊髓血管。加入羥胺中和游離的TMT分子,混合各組樣品后脫鹽。

      1.2.3 高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)分級(jí)和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatograph-mass spectrometry,LC-MS/MS)的檢測(cè):為了提高質(zhì)譜檢測(cè)到的蛋白質(zhì)數(shù)量,使用HPLC對(duì)肽段進(jìn)行分組。簡(jiǎn)要步驟為:多肽溶解于100 μL 1%甲酸溶液中,注入HPLC分離。分離色譜柱為Xbridge BEH300 C18 柱子(4.6 mm×250 mm,Waters),柱溫維持45 ℃;流動(dòng)相為乙腈和水(pH=10),流速為1 mL/min;紫外吸收波長(zhǎng)設(shè)為214 nm。每1.5 mL收集為1管,最終合并為12組分,旋蒸去除所有溶劑。

      將上述12組分分別溶解于20 μL 1%甲酸溶液中,進(jìn)行LC-MS/MS (Thermo Q Exactive質(zhì)譜儀)檢測(cè)。梯度洗脫條件:C18分析色譜柱(300 ?,75 μm×150 mm),0.30 μL/min,120 min。質(zhì)譜檢測(cè)條件:Q Exactive質(zhì)譜采取數(shù)據(jù)依賴(lài)性采集模式,Orbitrap(400-1 800 m/z,60 000分辨率)中行全譜掃描,隨后以27%碰撞能量(higher-energy C-trap dissociation,HCD)進(jìn)行10次數(shù)據(jù)依賴(lài)的MS/MS掃描。

      質(zhì)譜獲得的數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 2.2軟件進(jìn)行搜庫(kù),人源fasta數(shù)據(jù)庫(kù)于2020年10月在Uniprot網(wǎng)站下載。

      1.2.4 生物信息學(xué)分析:可信蛋白質(zhì)的篩選條件設(shè)置為:unique peptide≥2,F(xiàn)DR≤0.01,差異蛋白質(zhì)的篩選條件設(shè)置為:變化倍數(shù)≥2.0或≤0.5。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)分析使用到多個(gè)分析平臺(tái)和軟件:悟空云平臺(tái)(https://www.omicsolution.org/wkomics/main/)進(jìn)行PCA、HCA、相關(guān)性分析,F(xiàn)unrich軟件進(jìn)行Gene Ontology分析,Cytoscape軟件進(jìn)行ClueGO和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析,網(wǎng)絡(luò)版WEB-based GEne SeT Analysis Toolkit進(jìn)行Wikipathway分析,GraphPad Prism輔助作圖。

      1.2.5 蛋白質(zhì)表達(dá)水平的驗(yàn)證:通過(guò)Western blot驗(yàn)證蛋白質(zhì)在bAVM、sAVM、對(duì)照腦血管和對(duì)照脊髓血管中的表達(dá)水平。由于蛋白質(zhì)總量有限,將各組的樣本按照等質(zhì)量混合。使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度后,將各組蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分離,通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色確定各組上樣量。將等質(zhì)量蛋白通過(guò)SDS-PAGE分離,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉后,使用1∶1 000稀釋的一抗(MMP9,ab137867,Abcam;VDAC,cst-4866,Cell Signaling Technology公司)在4 ℃ 孵育過(guò)夜。與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h,化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗原抗體結(jié)合條帶。

      2 結(jié)果

      2.1 高通量質(zhì)譜檢測(cè)bAVM和sAVM中蛋白質(zhì)表達(dá)譜的異同

      在對(duì)照腦血管、bAVM血管、對(duì)照脊髓血管、sAVM血管中共檢測(cè)到3 102個(gè)高可信度蛋白質(zhì)。對(duì)照組腦血管和脊髓血管的蛋白質(zhì)表達(dá)譜相近,相關(guān)性系數(shù)為0.98,bAVM畸形血管中蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度與其他3組的差異最大(圖1)。

      A.PCA analysis;B.HCA analysis;C.correlation analysis圖1 對(duì)照腦血管和脊髓血管的蛋白質(zhì)表達(dá)譜相近Fig 1 Similar protein profiling in control cerebral vessels and spinal vessels

      bAVM畸形血管中蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生變化的蛋白質(zhì)數(shù)量更多(圖2A)。相比于對(duì)照組血管,bAVM畸形血管中286個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量下調(diào),566個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量上調(diào);sAVM畸形血管中90個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量下調(diào),115個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)量上調(diào)。bAVM和sAVM中表達(dá)量變化的蛋白質(zhì)共941個(gè),其中116個(gè)蛋白質(zhì)在兩種畸形血管中的表達(dá)量均顯著改變(圖2B)。在本研究中,將這941個(gè)蛋白質(zhì)定義為全部差異表達(dá)蛋白質(zhì)。

      941個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的HCA分析結(jié)果顯示(圖2C),這些蛋白質(zhì)可分為12個(gè)cluster,其中cluster 4中304個(gè)蛋白質(zhì)僅在bAVM血管中顯著高表達(dá),cluster 5中97個(gè)蛋白質(zhì)僅在sAVM血管中顯著高表達(dá)。后續(xù)對(duì)cluster 4和cluster 5中的蛋白質(zhì)分別進(jìn)行分析。

      A.satter plot displayed protein expression alterations in bAVM and sAVM;B.venn map showed that a total of 941 DEPs were detected,among which 116 proteins were found in both groups;C.HCA analysis of 941 DEPs,proteins in cluster 4 were specially upregulated in bAVM,and proteins in cluster 5 were specially upregulated in sAVM

      2.2 bAVM畸形血管細(xì)胞中線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)及鈣調(diào)節(jié)失衡

      在bAVM中顯著高表達(dá)的304個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要為線(xiàn)粒體及相關(guān)蛋白質(zhì),富集于線(xiàn)粒體復(fù)合物I、電子傳遞鏈、鈣調(diào)節(jié)等信號(hào)通路(圖3)。

      FDR.false discovery rate; A.gene ontology analysis; B.wikipathway analysis of 304 proteins in cluster 4圖3 bAVM畸形血管中線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)及鈣調(diào)節(jié)失衡Fig 3 Mitochondria dysfunction and calcium dysregulation in bAVM

      2.3 sAVM中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)及其糖基化異常

      sAVM畸形血管中顯著高表達(dá)的97個(gè)蛋白質(zhì)(cluster 5)主要是以ADAM10(disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10)、MMRN1(multimerin-1)、TNC(tenascin)、VCAN(versican core protein)、KNG1(kininogen-1)、LAMB1(laminin subunit beta-1)為核心的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白或糖蛋白(圖4)。

      A.gene ontology; B.protein-protein interaction analysis of 97 proteins in cluster 5圖4 sAVM中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)及其糖基化異常Fig 4 Alteration of extracellular matrix organization and proteoglycans in sAVM

      2.4 Western blot檢測(cè)bAVM和sAVM中蛋白質(zhì)表達(dá)水平

      線(xiàn)粒體蛋白VDAC(voltage-dependent anion channel)在bAVM中顯著高表達(dá),細(xì)胞外基質(zhì)蛋白MMP9(matrix metalloproteinase-9)在sAVM中顯著高表達(dá)(圖5)。

      A.coomassius blue staining;B.Western blot analysis圖5 Western blot檢測(cè)VDAC和MMP9在bAVM和sAVM中的表達(dá)水平Fig 5 Western blot verification of VDAC and MMP9 in bAVM and sAVM

      3 討論

      蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象,可無(wú)偏見(jiàn)的、在整體水平探究細(xì)胞或組織的蛋白質(zhì)組成及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。探究bAVM和sAVM的蛋白質(zhì)組表達(dá),可系統(tǒng)地評(píng)估兩種疾病的相似和差異,為尋找疾病的特異性分子機(jī)制或靶標(biāo)提供線(xiàn)索。

      前期蛋白質(zhì)組學(xué)研究報(bào)道,參與細(xì)胞間通訊的分子黏附通路蛋白質(zhì)的表達(dá)水平在人bAVM和sAVM畸形血管中均顯著改變[4-5]。本文中,作者發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)及鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平在bAVM中明顯改變,細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)在sAVM中顯著高表達(dá)。該結(jié)果揭示了bAVM和sAVM特異性的分子特征,為充分理解bAVM和sAVM的分子機(jī)制提供參考和補(bǔ)充。

      線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的鈣離子儲(chǔ)存器,VDAC是線(xiàn)粒體外膜上高表達(dá)的鈣轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,通過(guò)Grp75(glucose related protein 75)偶聯(lián)IP3Rs形成大分子轉(zhuǎn)運(yùn)體,介導(dǎo)線(xiàn)粒體外膜將鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至線(xiàn)粒體內(nèi)[8]。鈣離子可直接激活電子傳遞鏈和ATP合酶的活性,促進(jìn)ATP生成[9],調(diào)控線(xiàn)粒體能量代謝。在心肌細(xì)胞中,抑制線(xiàn)粒體復(fù)合物I可引起線(xiàn)粒體能量異常,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。本文結(jié)果顯示bAVM中多個(gè)線(xiàn)粒體復(fù)合物I蛋白的表達(dá)水平顯著升高,推測(cè)線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)及鈣調(diào)節(jié)失衡在bAVM的病理過(guò)程中可能具有重要調(diào)節(jié)作用。

      細(xì)胞外基質(zhì)是存在于細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),由膠原、蛋白聚糖、彈性纖維等大分子物質(zhì)組成。通過(guò)與細(xì)胞表面上的受體結(jié)合,調(diào)控細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu),引起細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞傳導(dǎo),影響細(xì)胞的增殖和分化?;|(zhì)金屬蛋白酶ADAM10-Notch通路、細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白TNC-RhoA/ROCK通路可影響內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接參與血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[11-13]。細(xì)胞外基質(zhì)黏附蛋白MMRN1結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞 vWF(von Willebrand factor),穩(wěn)定血小板黏附[14]。通過(guò)ADAMTS5水解VCAN成為versikines,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、增殖,促進(jìn)新生血管形成[15]。在本研究中,作者發(fā)現(xiàn)以ADAM10、TNC、VCAN、MMRN1為核心的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及糖蛋白的表達(dá)水平在sAVM中過(guò)表達(dá),在bAVM中的變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示細(xì)胞外基質(zhì)組成對(duì)sAVM血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要調(diào)控作用。

      本文仍存在一定的局限性:本文結(jié)論是基于小樣本量蛋白質(zhì)組學(xué)分析的推測(cè),需在大數(shù)量樣本上進(jìn)行驗(yàn)證,并在細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)該結(jié)論。

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