朱 萌，張 寧，陶 偉

(1.寧夏醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004； 寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院 2.病理科； 3.消化內科，寧夏 銀川 750004)

胃癌(gastric cancer)腹膜轉移發(fā)生機制不明，治療手段欠缺、預后差、病死率高。當前針對腹膜轉移的研究，多集中在癌細胞的侵襲轉移能力和轉移的分子調控上，對于轉移的受體，腹膜細胞成分的變化卻較少深入闡明，而腹膜間皮細胞的損傷或暴露引起的表型變化卻是癌細胞能否種植于腹膜上的必要環(huán)節(jié)[1]。本研究前期工作表明胃癌細胞系AGS富集外泌體，且miRNA-106a(miR-106a)在胃癌中特異性表達，并鑒定直接靶點Smad7和TIMP2[2-3]。但是關于外泌體miR-106a靶向Smad7/TIMP2對腹膜間皮表型的影響并不清楚。本研究在此基礎上，從轉移的受體腹膜間皮細胞入手，考察AGS細胞外泌體源miR-106a對腹膜間皮細胞系HMrSV5增殖、凋亡、遷移等表型以及靶基因Smad7、TIMP2和下游效應分子MMP2、MMP9、α-SMA表達的影響，探索外泌體miR-106a在胃癌腹膜轉移中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及細胞

主要試劑：胎牛血清(Gibco公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胰蛋白酶(Genview公司)；LipofectamineTM2000和外泌體提取試劑盒(Invitrogen公司)；EdU檢測試劑盒(Ribobio公司)；Transwell小室(Costor公司)；Matrigel基底膜基質(Corning公司)；GW4869≥90%純度、重組人TGF-beta 1蛋白(Aldrich-Sigma公司)；hsa-miR-106a mimic/inhibitor (Genepharma公司)；TRIzol(TaKaRa公司)；qPCR檢測試劑盒(DBI公司)；Smad7兔多克隆抗體(Proteinteck公司)；Smad2/3兔多克隆抗體(CST公司)；p-Smad2/3兔單克隆抗體(R&D公司)；TIMP2、MMP9兔多克隆抗體(Immunoway公司)；MMP2、α-SMA兔多克隆抗體(SAB公司)。人源胃癌細胞系AGS和腹膜間皮細胞系HMrSV5購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 外泌體的提?。吼囸I培養(yǎng)AGS細胞2 d后，吸棄上清液，2 000 r/min離心20 min，用微孔濾膜過濾，去除細胞和其他亞細胞結構物質；加入外泌體提取試劑(1∶2)，顛倒混勻；4 ℃孵育過夜；次日4 ℃ 10 000×g離心1 h；棄上清，PBS重懸，獲得外泌體于-80 ℃冰箱保存1周備用。PBS重懸外泌體，得到PBS-Exo，工作劑量8 μg。

1.2.2 細胞的分組及處理：本研究分3個部分：1)AGS細胞來源外泌體與HMrSV5細胞共培養(yǎng)。分組：Exo-control和Exo-GW4869。GW4869藥物濃度為10 μmol/L，作用時間24 h。2)AGS細胞轉染miR-106a mimic或inhibitor后與HMrSV5細胞共培養(yǎng)。分組：Exo-control、Exo-mimic、Exo-inhibitor。miRNA mimic/inhibitor采用LipofectamineTM2000轉染，濃度50 nmol/L。3)AGS細胞來源外泌體與TGF-β處理后HMrSV5細胞共培養(yǎng)。分組：TGF-β、TGF-β-Exo。TGF-β重組蛋白濃度10 ng/mL，作用時間48 h。

1.2.3 qPCR檢測細胞miR-106a表達：TRIzol法提取RNA?？俁NA模板量1 μg，加入RNase-free H2O，總體系10 μL。取7.0 μL，加入5×反轉錄緩沖液 2.0 μL，miRNA RT 0.25 μL，U6 R 0.25 μL，RT反轉錄酶0.5 μL，總體系10 μL。37 ℃ 15 min，98 ℃ 5 min，合成cDNA第一鏈。取cDNA 1 μL，加入Bestar? SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，miRNA F(10 μmol/L)0.5 μL，ALL R(10 μmol/L)0.5 μL，ddH2O 8 μL，總體系20 μL。反應條件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。融解曲線分析：94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，94 ℃ 30 s。PCR使用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P進行。miR-106a 反轉錄引物：5′-CTCAA CTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCTG C-3′；miR-106a 正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGG AAAAGTGCTTACAGTGCA，反向引物：5′-CTCAACT GGTGTCGTGGA-3′。按照2-△△Ct方法處理數據。

1.2.4 EdU檢測細胞增殖：將HMrSV5細胞置于96孔板，每孔加入100 μL 濃度為50 μmol/L EdU培養(yǎng)基孵育2 h；棄培養(yǎng)基，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min，50 μL甘氨酸2 mg/mL孵育5 min，100 μL滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS)孵育10 min；PBS清洗后加入100 μL 1×Apollo染色液，避光孵育30 min，棄染色反應液；加入100 μL滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS)脫色搖床清洗2～3次，每次10 min，棄滲透劑；加入100 μL 1× Hoechst 33342反應液，避光孵育30 min，棄染色反應液；PBS清洗，倒置熒光顯微鏡(Leica DMI6000B)觀察拍照。每組設3個復孔。

1.2.5 流式細胞測量術檢測細胞凋亡：將HMrSV5細胞置于6孔板，胰蛋白酶消化制成單細胞懸液；將單細胞懸液移至流式管，PBS洗滌2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用500 μL 1×緩沖液重懸細胞，然后取兩管樣本分別加入5 μL annexin V-FITC 和 10 μL PI，避光孵育15 min，上機檢測。

1.2.6 Transwell小室法檢測細胞遷移：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)HMrSV5細胞12 h，胰蛋白酶消化，用含0.2% BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞濃度為2×105個/mL，取100 μL加入Transwell上室，下室加入700 μL 10% FBS完全培養(yǎng)基；5% CO2、37 ℃常規(guī)培養(yǎng)48 h；PBS洗滌，4%多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色5～10 min，封片鏡檢。

1.2.7 Western blot檢測Smad7、TIMP2、MMP2、MMP9、α-SMA、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達：將HMrSV5細胞按5×105個/mL接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h后提取總蛋白，繪制標準曲線，進行BCA蛋白定量。經SDS-PAGE進行分離，上樣量20 μg，100 V恒壓電泳，待樣品進入分離膠后，升壓至120 V，總時長1.5 h。300 mA恒流轉膜。5%脫脂奶粉-TBS封閉。孵育一抗(Smad7 1︰1 000，TIMP-2 1︰2 000，MMP2 1︰2 000，MMP9 1︰2 000，α-SMA 1︰2 000，Smad2/3 1︰1 000，p-Smad2/3 1︰500，GAPDH 1︰10 000)，孵育二抗(HRP山羊抗兔IgG 1︰20 000)，TBST洗滌。化學發(fā)光、顯影、定影。凝膠圖像分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 AGS細胞源外泌體miR-106a表達及對HMrSV5細胞增殖和凋亡的影響

AGS細胞內和外泌體內miR-106a的差異表達，與AGS-control組相比，AGS-Exo組miR-106a表達量增高(P<0.01)。細胞增殖實驗，與Exo-control組相比，Exo-GW4869處理后，HMrSV5細胞EdU標記陽性細胞數增加，細胞增殖能力增強(圖1)。早期凋亡率兩組相比，Exo-GW4869組明顯降低(P<0.05)(圖2)。

圖1 EdU法檢測HMrSV5細胞增殖能力Fig 1 Proliferation ability of HMrSV5 cells was detected by EdU assay (scale bar=50 μm)

2.2 AGS細胞源外泌體miR-106a對HMrSV5細胞遷移的影響

細胞遷移實驗，與Exo-control組相比，Exo-mimic組HMrSV5細胞遷移率明顯增強(P<0.001)，Exo-inhibitor組明顯下降(P<0.001)(圖3)。

2.3 AGS細胞源外泌體miR-106a對HMrSV5細胞Smad7及相關蛋白表達的影響

與Exo-control相比，Exo-mimic組HMrSV5細胞Smad7、TIMP2蛋白表達顯著降低(P<0.001)，MMP2、MMP9、α-SMA蛋白表達顯著升高(P<0.001)；Exo-inhibitor組Smad7表達升高(P<0.01)，MMP2、MMP9、α-SMA表達明顯降低(P<0.001)(圖4)。

2.4 TGF-β處理后外泌體對Smad7及相關蛋白表達的影響

與TGF-β處理組相比，TGF-β-Exo組HMrSV5細胞Smad7蛋白表達降低(P<0.001)，而Smad2/3及磷酸化p-Smad2/3蛋白表達升高(P<0.001)(圖5)。

*P<0.05 compared with Exo-control group圖2 流式細胞測量術檢測HMrSV5細胞凋亡率Fig 2 Apoptosis rate of HMrSV5 cells was detected by flow cytometry n=3)

*P<0.001 compared with Exo-control group圖3 Transwell小室法檢測HMrSV5細胞遷移能力Fig 3 Migration ability of HMrSV5 cells was detected by Transwell assay(scale bar=100 μm) n=3)

3 討論

外泌體是一種細胞外物質，在其生物發(fā)生過程中會包裹起源細胞重要信息分子如蛋白質、核酸、脂類及其他代謝物等，可能參與了腫瘤轉移過程中的細胞間通訊[4-5]。其中， 核酸類分子中的miRNA就是外泌體的重要包裹物。關于外泌體miRNA在腫瘤轉移中的研究顯示miRNA經由外泌體的定向轉運參與調控惡性腫瘤的器官特異性轉移，但具體的作用機制仍有待于深入探索。胃癌腹膜轉移是一種器官特異性的轉移方式，是由癌細胞出發(fā)，到腹膜移植瘤形成的過程。本研究以外泌體為介質，檢測外泌體內miR-106a的表達，發(fā)現差異表達的miR-106a分子尤其富集于AGS細胞源外泌體中，提示miR-106a可能參與了外泌體所介導的細胞間通訊，進而可能在胃癌的腹膜轉移中發(fā)揮作用。

*P<0.001, #P<0.01 compared with Exo-control group圖4 蛋白質印跡法檢測HMrSV5細胞Smad7及相關蛋白表達

*P<0.001 compared with TGF-β group圖5 蛋白質印跡法檢測HMrSV5細胞TGF-β干預后Smad7、Smad2/3、p-Smad2/3蛋白表達

腹膜細胞構成中最表層的是間皮細胞，間皮細胞的完整性和表型的維持是阻止胃癌等惡性腫瘤發(fā)生癌性腹膜播散的屏障[6]。腹膜完整性的保存是間皮細胞增殖和凋亡平衡的結果。本研究顯示AGS細胞外泌體抑制HMrSV5細胞增殖，促進細胞凋亡，可能是破壞間皮完整性的一種介質。關于間皮細胞遷移率的實驗表明AGS細胞miR-106a表達調控功能增強或減弱的同時，其來源外泌體也能夠增強或減弱HMrSV5細胞的遷移能力。間皮細胞增殖、凋亡、遷移等表型可能至少在胃癌AGS細胞外泌體源miR-106a的作用下發(fā)生改變，這將是腹膜完整性損傷的一種促進因素。為進一步考察發(fā)生此類表型轉化的原因，本研究檢測miR-106a雙靶點Smad7和TIMP2及相關效應分子。Smad7是屬于SMAD家族的一種結合E3泛素連接酶的核蛋白，能夠與TGF-β相互作用導致TGF-β降解[7-8]，據報道TGF-β在Smad依賴的情況下介導細胞發(fā)生EMT、MMT轉化[9-10]。MMP與相應的TIMP表達之間具有負相關性，MMPs/TIMPs平衡主要參與對腫瘤侵襲性的抑制作用。MMP2/TIMP2有利于維持ECM的平衡和降解[11]。本研究發(fā)現Smad7、TIMP2隨miR-106a表達的干預而增強或減弱的同時間質標志物α-SMA，及MMP2/9發(fā)生相反變化，而TGF-β重組蛋白的逆向觀察發(fā)現Smad7表達減低的同時Smad2/3及p-Smad2/3表達升高。這些結果一方面表明AGS細胞外泌體具有促使腹膜間皮細胞獲得間質樣表型的作用[12]，另一方面也表明外泌體對間皮細胞的作用在于其轉運的miR-106a對靶基因及相關效應通路的影響。