王建超 何銀鶯 黃旭萍 沈朝貴 陳發(fā)興 郭林榕

摘要：【目的】優(yōu)化余甘子種質(zhì)資源ISSR-PCR反應(yīng)體系，為余甘子種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究提供基礎(chǔ)?！痉椒ā恳跃挼椤⒂《?、廣東、云南、福建等5份來源小同的余甘子種質(zhì)資源的基因組DNA組成混合的DNA模板，綜合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，分析引物濃度、2×Taq Master Mix添加量、DNA模板量、退火溫度等反應(yīng)條件對(duì)IS SR-PCR反應(yīng)體系的影響，優(yōu)化建立余甘子IS SR-PCR反應(yīng)體系?！窘Y(jié)果】引物濃度和2×Taq MasterMix添加量對(duì)擴(kuò)增效果有較大影響，DNA模板量影響較小;引物濃度和DNA模板量交互作用明顯;余甘子ISSR反應(yīng)體系為引物濃度0.4 umol L-l，2×Taq Master Mix添加量l3 uL， DNA模板量30 ng，擴(kuò)增結(jié)果與響應(yīng)面分析模型理論值相對(duì)誤差儀為9.39%;退火溫度為50.5- 52.7℃時(shí)，隨著溫度的升高，條帶質(zhì)量變好，數(shù)量變多，退火溫度為52.7℃時(shí)可獲得多樣性好的清晰條帶。【結(jié)論】獲得ISSR-PCR反應(yīng)體系為引物濃度0.4 umoI·L-1，2×Taq MasterMix添加量13 UL， DNA模板量30 ng，退火溫度52.7℃，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)35循環(huán)，擴(kuò)增獲得的條帶清晰、穩(wěn)定，多樣性好，該體系適于余甘子種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系等分析研究

關(guān)鍵詞：余甘子;ISSR-PCR;響應(yīng)面;體系優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S 682.310.36

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-0384（ 2021） 07-075907

Response Surface Optimization of ISSR-PCR Reaction for Genetic Study on

Phyllanthus Emblica

WANG Jianchao1.2. HE Yinying2. HUANG Xuping2， SHEN Chaoguj1， CHEN Faxing2. Guo Linrong1*

（l.Fruit Research Institute， Fujian Academy ofAgricultural Sciences. Fuzhou， Fujian 350013，China：

2.College ofHorticulture， Fujian Agriculture and Forestrv University. Fuzhou， Fujian 350002. China）

Abstract： 【Objective】 ISSR-PCR reaction system for genetic study on Phyllanthus emblica germplasms was optimized【Methods】 A mixed DNA template composed of genomic DNA ofP emblica germplasms came from Myanmar. India.Guangdong， Yunnan， and Fujian was obtained. The single factor test and response surface analysis were used to optimize theISSR-PCR reaction conditions including primer concentration. amount of 2×Taq Master Mix. DNA template amount， andannealing temperature.【Result】 The primer concentration and addition amount of 2×Taq Master Mix had a greater impacton the amplification than did the DNA template amount. A significant interaction between the primer concentration and DNAtemplate amount was found. The optimized system with a primer concentration of 0.4 ymoI·L-1.a 2×Taq Master Mix of13 UL， and a DNA template concentration of 30 ng was established that achieved a low relative error of 9.39% in predicting thetheoretical response. Within the annealing temperature between 50.5 ℃ and 52.7 ℃. increasing temperature improved thenumber and quality of bands. When the annealing temperature is 50.5-52.7.C，the number of strips increases. and the quality ofthe strips becomes better with the increase of temperature. The annealing temperature is 52.7℃to obtain good diversity andclear bands. 【Conclusion】 The optimized ISSR-PCR reaction system was established applying a primer concentration of0.4 umoI-L-1，a 2×Taq Master Mix ofl3L，aDNA template concentration of 30 ng at the annealing temperature of 52.7℃for35 amplification cycles. The methodology could be used to study the genetic diversity and relationship of P. emblicagermplasms .

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016、Design Expert 8.0.6等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和模型的建立。

2結(jié)果與分析

2.1單因素對(duì)ISSR反應(yīng)體系的影響

單因素試驗(yàn)的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2，可見，引物濃度與2×Taq Master Mix添加量對(duì)反應(yīng)體系的影響較大。引物濃度偏高或偏低都會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果，引物濃度過高會(huì)引起引物與DNA模板錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，增加產(chǎn)生二聚體的概率，引物濃度偏低則不易測(cè)出擴(kuò)增位點(diǎn)，本研究引物濃度為0.30～0.40 umol.L-l時(shí)電泳效果較好。2×Taq Master Mix含有Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和Mg2+等反應(yīng)原料，Taq DNA聚合酶直接影響擴(kuò)增反應(yīng)的成功與否，濃度過高容易產(chǎn)生非特異的PCR產(chǎn)物，dNTP是ISSR分子標(biāo)記擴(kuò)增的重要原料，濃度過高易錯(cuò)配，過低影響合成效率，2×Taq MasterMix添加量為12～14 uL為最佳。DNA模板量范圍取決于物種基因組大小和DNA純度，研究表明，DNA模板量對(duì)余甘子ISSR-PCR的影響較小，考慮電泳條帶質(zhì)量和數(shù)量，選擇DNA模板量最佳為30 ng。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化ISSR反應(yīng)體系

以電泳圖譜（圖3）中電泳條帶數(shù)量、清晰度、重復(fù)性、亮度和背景干凈程度的評(píng)分（5名科研T作者主觀評(píng)分）為響應(yīng)值（表4），采用多元回歸擬合，獲得引物濃度（X1），2×Taq Master Mix添加量（X2），DNA模板量（X3）的二次多項(xiàng)回歸模型為F=11.92-0.437 5X1-O.5 5X2 -1.737 5X2-0.75XIX21.575XIX3-0.55X2X3-4.2975Xl2-3.5225X2--2.1975X32。檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析電泳圖評(píng)分為響應(yīng)值時(shí)，該二次方程模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p-0.012 6<0.05），說明該模型對(duì)本試驗(yàn)有較好擬合;回歸方程失擬性檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p-0.7571），表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小，模型能較好地反應(yīng)真實(shí)的試驗(yàn)值，可用于響應(yīng)值的分析和預(yù)測(cè)，所得的回歸方程模型能較好地預(yù)測(cè)電泳圖譜得分隨各參數(shù)的變化規(guī)律。試驗(yàn)所選三因子X1、X2和X3中X3達(dá)到顯著影響（p<0.05），Xl、X2因子二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著影響（p<0.001）表明單因素X2對(duì)響應(yīng)結(jié)果影響較大，且X1與X2因子有極顯著的交互影響。

根據(jù)回歸擬合方程得出各試驗(yàn)因子引物濃度（X）、2×Taq Master Mix添加量（X2）、DNA模板量（X3）兩兩因素交互作用的等高線圖（圖4），等高線圖可直觀反映出2個(gè)變量間交互作用的顯著程度，其中圓形表示兩兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩兩因素交互作用顯著[16];等高線圖由藍(lán)到紅的變化越快，沿白變量方向高度差越大[17]，引物濃度（Xl）和DNA模板量（X3）之間交互作用顯著。

根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件分析出的若干解決方案與其相應(yīng)預(yù)測(cè)得分值，考慮到保證高響應(yīng)值的同時(shí)節(jié)約成本，對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)分析驗(yàn)證，得到ISSR反應(yīng)體系的實(shí)際值（圖5），該值與理論預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較計(jì)算相對(duì)誤差，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，最優(yōu)實(shí)際解決方案引物濃度為0.40 umol·L-1，2×Taq Master Mix添加量為13.0 uL，DNA模板量30 ng，該條件與理論預(yù)測(cè)響應(yīng)值13.130 4的相對(duì)誤差僅為9.39%，說明該模型具有好的分析能力，可為實(shí)際操作提供良好的指導(dǎo)。

2.3退火溫度對(duì)ISSR反應(yīng)體系的影響

退火溫度影響ISSR圖譜的穩(wěn)定性，較低的退火溫度可保證引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定性，但較易產(chǎn)生錯(cuò)誤的擴(kuò)增。由電泳圖譜（圖6）可知，35循環(huán)數(shù)下，50.5～54.0℃隨著退火溫度的升高譜帶質(zhì)量與條帶數(shù)有較明顯的變化，退火溫度為50.5—52.7℃時(shí)，隨著溫度的升高條帶數(shù)呈增加趨勢(shì)，條帶質(zhì)量變好，52.7～54.0℃時(shí)，部分條帶模糊，缺失。選擇較高的退火溫度可減少引物和模板間非特異性的結(jié)合，提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，綜合譜帶質(zhì)量和條帶數(shù)，退火溫度為52.7℃時(shí)最佳，可獲得較好的擴(kuò)增效果。

通過優(yōu)化得到ISSR-PCR反應(yīng)的體系為引物濃度為0.4 umol·1-1，2×Taq Master Mix添加量為13 uL，DNA模板量30 ng，退火溫度為52.7 0C，循環(huán)次數(shù)35次;將該體系應(yīng)用于不同余甘子種質(zhì)資源效果見圖7，引物UBC841在該體系下可擴(kuò)增出條帶清晰和多態(tài)性良好的電泳圖譜，表明該體系適宜應(yīng)用于余甘子種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究。

3討論與結(jié)論

ISSR是在SSR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的分子標(biāo)記，目前，ISSR已廣泛用于植物品種鑒定、遺傳圖譜、遺傳多樣性及分子生態(tài)學(xué)研究[18.19]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)基于PCR反應(yīng)，其擴(kuò)增譜帶受反應(yīng)條件和擴(kuò)增程序變化以及物種不同的影響，采用不同的反應(yīng)體系組合和擴(kuò)增程序電泳結(jié)果差異較大，因此，開發(fā)ISSR分子標(biāo)記對(duì)其反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序優(yōu)化顯得必不可少。

本研究綜合運(yùn)用單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法，首先確定了各因素的有效范圍，再對(duì)各因素組合優(yōu)化，從而確立普遍適用于余甘子種質(zhì)資源的ISSR-PCR反應(yīng)體系。本研究PCR擴(kuò)增采用2×Taq MasterMix試劑，該試劑將多種擴(kuò)增原料混合，研究結(jié)果雖未能直觀體現(xiàn)Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+等原料對(duì)余甘子ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響[20]，但可大大提高T作效率，達(dá)到了節(jié)省物料、簡便、快速的目的，可在ISSR分子標(biāo)記研究中加以推廣應(yīng)用。本研究結(jié)果表明引物濃度對(duì)余甘子ISSR反應(yīng)體系影響較大，DNA模板量與引物濃度有顯著的交互作用，與前人研究較一致[21.22]。應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)影響ISSR反應(yīng)體系的主要因素進(jìn)行篩選，建立余甘子ISSR反應(yīng)體系模型F=11.92-0.437 5X1-0.55X2 1.737 5X30.75XIX2 1.575X1X3 0.55X2X3 4.297 5Xl2 3.522 5X222.197 5X22，可較快地得到最優(yōu)組合，避免了單因素試驗(yàn)結(jié)果的不足。

本研究確立余甘子ISSR-PCR反應(yīng)體系：引物濃度為0.4 UMol·1，2×Taq Master Mix添加量為13 UL，DNA模板濃度30 ng，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為35循環(huán)，退火溫度52.7℃;擴(kuò)增獲得的條帶清晰、穩(wěn)定，多樣性好，可應(yīng)用于余甘子種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系研究。

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（責(zé)任編輯：黃愛萍）

收稿日期：2021-03-16初稿：2021-05-12修改稿

作者簡介：王建超（1988-），男，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：熱帶與業(yè)熱帶果樹種質(zhì)資源保護(hù)與生理生化研究（Email： 447327289@qq.com）

通信作者：郭林榕（ 1963-），女，副研究員，研究方向：熱帶與業(yè)熱帶果樹種質(zhì)資源保存、選育種及栽培研究（Email： linrong-g@163com）

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃公益類專項(xiàng)（ 2019Rl028—ll）：國家熱帶植物種質(zhì)資源庫（余甘子種質(zhì)資源分庫）（NTPGRC2021-011）：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部物種品種（熱帶作物）資源保護(hù)項(xiàng)日（ 151821301354052701）