陳龍軍 林程 林陳強 張慧 賈憲波 方宇 陳濟琛

摘要：【目的】以麥飯石為載體，制備高效的納豆芽胞桿菌同體菌劑，為納豆芽胞桿菌的規(guī)?；瘧?yīng)用奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā窟\用酸、堿、鹽等方法探索麥飯石進(jìn)行改性條件，擴大麥飯石孔隙度及比表面積，提升其吸附能力;并通過添加保護劑（葡萄糖、糊精、淀粉）增加保藏期固體菌劑的有效活菌數(shù)殘留率，為長期保藏固體粉劑提供技術(shù)支持。【結(jié)果】 （1）確定了納豆芽胞桿菌最適培養(yǎng)溫度為40℃，最適培養(yǎng)pH為7.5。（2）經(jīng)氯化鈉、鹽酸、硫酸和氫氧化鈉溶液改性后的麥飯石吸附最大有效活菌數(shù)分別為13.17. 12.6、12.7和11.9（×108 CFU-g-1）。其中0 5mol L-1氯化鈉溶液改性效果最好，吸附有效活菌數(shù)達(dá)到13.17（×108 CFU·g-1）。（3）對照組、添加保護劑組（2%糊精、2%葡萄糖、2%淀粉）保藏至6個月時，有效活菌數(shù)分別為2.91. 4.1、5.42和4.63（×108 CFU·g-1）。活菌數(shù)殘留率為初始活菌數(shù)的22%、31%、41%和35%，其中2%葡萄糖保護劑比對照組有效活菌數(shù)殘留率提高了1.86倍。【結(jié)論】改性麥飯石能極大提升麥飯石的吸附能力，同時保護劑的添加有利于麥飯石固體芽胞桿菌粉劑的長期保藏，本研究為麥飯石在微生物菌劑制備工藝的應(yīng)用提供了一定的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：納豆芽胞桿;麥飯石;改性;保護劑;吸附

中圖分類號：Q 939.96

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2021） 07-0855-06

Functional Improvements on Immobilization Carrier of

Bacillus Culture for Natto Fermentation

CHEN Longjun1， LIN Cheng2. LIN Chenqiang1， ZHANG Hui1. JIA Xianbo1. FANG Yu1. CHEN Jichen1*

（ I. Soil and Fertilizer Institute， Fujian Acaderiy of Agricultural Sciences. Fuzhou. Fujian

350003. China;

2. Fuzhou Agricultural and Rural Bureau， Fuzhou， Fujian

350003. China ）Abstract： 【Objective】The physical properties of maifanshi. a volcanic rock. were modified to improve its porosity andadsorption to be used as an immobilization carrier for natto fermentation bacteria that was further added with protective agentsto extend the shelf life of viable Bacillus natto. 【Method】 Maifanshi was treated by acid. alkali. or salt to modify the porosityand surface adsorption property as a microbial carrier. Various protective agents， such as glucose. dextrin. and/or starch wereincorporated to help prolong the viability of the imbedded B. natto powder. 【Result】 （1） The optimum conditions for B. nattoculture included 40℃ and pH 7.5. （2） The maximum viable bacteria count was the highest at 13.17X 108 CFU·g-I on themaifanshi carriers modified by 0.5 mol·L-1sodium chloride solution. It was followed by a count of 12.7 X 108 CFU·g-1 0nmaifanshi treated by sulfuric acid. 12.6 X 108 CFU·g-l on maifanshi treated by hydrochloric acid. and 1 1 .9 X 108 CFU. g-l onmaifanshi treated by sodium hydroxide. （3） The viable B. natto counts after 6 months in storage on control was 2.91 X 108CFU·g-l as compared to those immobilized on the carriers with addition of 2% dextrin. 2% glucose， or 2% starch being4.1 X 108 CFU·g-1， 5.42X 10 8 CFU·g-1， and 4.63 X lOs CFU·g-1， respectively. The retention of viable B. natto on the NaCI-treated maifanshi with the addition of dextrin was 31%. that of glucose 41%. that of starch 35%. and that of control 22%.【Conclusion】 As a bacteria carrier. maifanshi could be significantly further improved on the adsorption capacity bymodification such as NaCI treatment. With an addition of 2% glucose on the immobilized system. the retained viable B. nattocount could rise l .86 times over control in 6 months of storage. It appeared that this study had paved the way of developing apractical application of maifanshi for natto fermentation industry.

2 結(jié)果與分析

2.1溫度對納豆芽胞桿菌生長的影響

為了研究適宜納豆芽孢桿菌生長的最佳溫度，在pH 7.0、150 r·mm_1條件下，設(shè)置溫度分別為30、35、40、45，50℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)18 h（對數(shù)生長末期）。由圖1可以看出，不同溫度下，納豆芽胞桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，進(jìn)入穩(wěn)定期后，有效活菌數(shù)各不相同，隨著培養(yǎng)溫度升高（ 25～40℃），有效活菌數(shù)逐漸升高，當(dāng)培養(yǎng)溫度為40℃時，有效活菌數(shù)達(dá)到最大值12.88×lOb CFU·mL-l。之后隨溫度繼續(xù)升高（ 40～50℃），有效活菌數(shù)逐漸降低，由此可見，納豆芽胞桿菌最適培養(yǎng)溫度為40 ℃。

2.2 pH對納豆芽胞桿菌生長的影響

為了研究適宜枯草芽孢桿菌生長的最佳pH值，將菌液pH值分別調(diào)節(jié)為5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5等7個梯度，分別放入最適培養(yǎng)溫度為40℃的震蕩搖床中培養(yǎng)至對數(shù)生長末期（18h），測其有效活菌數(shù)。pH對納豆芽孢桿菌生長的影響如下圖2所示。隨著培養(yǎng)pH升高（5.5～7.5），有效活菌數(shù)逐漸升高，當(dāng)培養(yǎng)pH為7.5時，有效活菌數(shù)達(dá)到最大值13.68×lOs CFU·mL-l。之后隨pH繼續(xù)升高（7.5～8.5），有效活菌數(shù)逐漸降低，由此可見，納豆芽胞桿菌最適培養(yǎng)pH為7.5。

2.3不同改性劑及濃度對載體吸菌效果的影響

采用不同濃度改性劑（酸、堿、鹽）對麥飯石進(jìn)行處理，考察改性后的麥飯石對納豆芽胞桿菌的吸附效果，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，在低濃度改性劑條件下（小于0.5mol·L-l），納豆芽孢桿菌的吸附有效活菌數(shù)隨著濃度升高，呈逐漸增長趨勢;究其原因，由于在較低的改性濃度下，天然麥飯石原本被堵塞的孔徑，在改性劑的作用下，逐漸被打通，隨著改性劑溶液濃度增加，改性效果漸好，吸附有效活菌數(shù)也隨之增加;當(dāng)改性劑濃度高于0.5 mol·L-l時，吸附納豆芽孢桿菌的有效活菌數(shù)隨著改性劑濃度增加而逐漸減少，這可能是由于過高改性劑濃度對納豆芽孢桿菌活性產(chǎn)生了抑制的緣故，因此當(dāng)改性劑濃度超過一定值后，吸附的有效活菌數(shù)反而隨濃度升高而降低。以未改性麥飯石為對照[（ 11.35±0.35）×10 8 CFU·g-l]，當(dāng)改性劑濃度為o.5mol·L-l時，吸附納豆芽孢桿菌有效活菌數(shù)均達(dá)到最大值，經(jīng)氯化鈉、鹽酸、硫酸和氫氧化鈉溶液改性后的麥飯石吸附最大有效活菌數(shù)分別13 .17±0.44、12.6±0.33、12.7±0.38和11.9±0.42（×108 CFU·g-l）。其中，0.5 mol·L-l氯化鈉溶液改性的麥飯石，其吸附納豆芽孢桿菌效果最好，吸附有效活菌數(shù)達(dá)到13.17±0.44（×108CFU·g-l）。

2.4改性前后吸附效果比較

由表1可以看出，未改性麥飯石吸附納豆芽胞桿菌有效活菌數(shù)為11.35±0.35（×108 CFU·g-l），吸附率83%;而經(jīng)過0.5 mol.L-l NaC1溶液改性的麥飯石有效活菌數(shù)達(dá)到了13.17±0.44（×lOs CFU·mL-l），吸附率達(dá)96.3%，相比未改性前，吸附率提高了13 .3%。究其原因，多孔性海綿結(jié)構(gòu)的麥飯石經(jīng)NaC1溶液改性后，空隙打開，比表面積增大，加之麥飯石較強的靜電吸附力，從而進(jìn)一步提高了其吸菌效率。由此可見，改性麥飯石在微生物固體菌劑制備中具有重要應(yīng)用價值。

2.5載體固定化微生物

為更直觀地反映麥飯石改性前后對納豆芽孢桿菌吸附效果的影響，通過掃描電鏡觀察麥飯石表面結(jié)構(gòu)變化，如圖4所示。2 500倍掃描電鏡下可以清晰的看出，與未改性麥飯石（圖4-A）相比，改性后的麥飯石（圖4-B）表面去除了許多細(xì)小顆粒、雜質(zhì)，大量的空隙被疏通，極大提高了載體孔隙度和比表面積。改性麥飯石吸附菌液后（圖4-C），觀察到載體大量空隙被納豆芽胞桿菌充滿，同時表面附著大量的納豆芽孢桿菌，結(jié)合表1載體吸附率，進(jìn)一步說明改性麥飯石具有更強的吸菌能力。

2.6保護劑對固化菌劑保藏期的影響

固態(tài)菌劑保藏費用低、可以直接投入發(fā)酵，且在運輸和貯藏、質(zhì)量控制等方面有其獨特的優(yōu)勢。本文考察了3種保護劑（糊精、葡萄糖、淀粉）在納豆芽胞桿菌固體菌劑中的應(yīng)用效果。結(jié)果如圖5所示，未添加保護劑的對照組在整個保藏期內(nèi)，菌劑有效活菌數(shù)始終低于同時期的試驗組（2%糊精、2%葡萄糖、2%淀粉）。菌劑保藏第一個月，添加保護劑的試驗組，有效活菌數(shù)均有不同程度提高，尤其是葡萄糖作為保護劑時，有效活菌數(shù)達(dá)到13.65×lOs CFU·g-1，而對照組略有下降;從第二個月開始，隨著保藏期的延長，有效活菌數(shù)均呈下降趨勢，保藏至6個月時，對照組、糊精、葡萄糖、淀粉有效活菌數(shù)分別為2.91、4.1、5.42、4.63（×10 8 CFU·g-l），活菌數(shù)殘留率為初始活菌數(shù)的22%、31%、41%、35%。與對照組相比，添加不同保護劑均有效提高了活菌數(shù)的殘留率，其中添加葡萄糖保護劑的有效活菌數(shù)殘留率提高了1.86倍。由此可見，保護劑的添加，對納豆芽胞桿菌固體粉劑的保藏具有重要影響。

3討論與結(jié)論

本研究首先對納豆芽胞桿菌的液體培養(yǎng)條件進(jìn)行初步研究，確定其最適培養(yǎng)溫度為40℃，最適培養(yǎng)pH為7.5，在150r.mm_1條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)18h（對數(shù)生長末期），有效活菌數(shù)可達(dá)13.68×lOs CFU·mL-l。其次，在不同改性條件下，對麥飯石進(jìn)行處理，確定了經(jīng)0.5 mol·L-l NaC1溶液改性后麥飯石吸附納豆芽胞桿菌效果最好，有效活菌數(shù)達(dá)13.17×lO 8 CFU·g-1，相比未改性前，吸附率提高了13 .3%。最后，考察不同保護劑對納豆芽胞桿菌固體粉劑保藏期的影響，確定2%的葡萄糖保護劑效果最好，經(jīng)過6個月保藏期后，其有效活菌數(shù)5.42×lO 8 CFU·g-1，有效活菌數(shù)殘留率達(dá)41%，是對照組的1.86倍。

麥飯石表面帶有大量陽離子，具有強烈靜電引力及離子交換功能;氯化鈉溶液作為改性劑，通過鈉離子交換，改變了麥飯石表面結(jié)構(gòu)中的陽離子，使麥飯石靜電場加強，從而增強了對芽胞桿菌的吸附能力。另外，由于強酸強堿環(huán)境會殺死或抑制微生物生長，而偏中性的氯化鈉更適合微生物生長，因此，同濃度下鹽（氯化鈉）改性效果始終高于酸堿（鹽酸、硫酸、氫氧化鈉）。此外葡萄糖保護劑效果優(yōu)于糊精及淀粉，究其原因，首先葡萄糖作為小分子保護劑，具有很強的親水性，分子結(jié)構(gòu)含有3個以上氫鍵，在干燥過程中，可與芽胞桿菌菌體細(xì)胞膜磷脂中的磷酸基團或菌體蛋白質(zhì)極性基團形成氫鍵，保護細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域功能的完整性[17]，其次葡萄糖可作為碳源直接被微生物吸收利用，為微生物提供一定的營養(yǎng)，保證芽胞桿菌在干燥的保藏環(huán)境中仍能維持一定的生長，使其保藏初期固體菌劑有效活菌數(shù)有一定幅度的提升，同時在整個保藏期內(nèi)維持著一定的養(yǎng)分水平，使其活菌數(shù)殘留率相比對照組明顯提升。

有鑒于改性麥飯石對其吸附能力的巨大潛力，在本研究的基礎(chǔ)上考慮進(jìn)一步采用熱改性、Mn02改性、稀土鑭改性等方法，進(jìn)一步提升麥飯石吸附能力，制備高效的微生物固體粉劑，同時可用于農(nóng)牧漁業(yè)，醫(yī)藥衛(wèi)生及食品釀造業(yè)等，也可用于日用化學(xué)，環(huán)境保護等方面，提高其市場應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)：

[1]林先貴，胡君利上壤微生物多樣性的科學(xué)內(nèi)涵及其生態(tài)服務(wù)功能[J]上壤學(xué)報，2008，45 （5）：892-900

LIN X G.HU J L Scientifc connotation and ecological servicefunction of soil microbial diversity [J]. Acta Pedologica Sinica，2008，45 （5）： 892900 （in Chinese）

[2]許杰龍，張國霞，許玫英，等餐廚廢棄物資源化利用的微生物技術(shù)研究進(jìn)展[J]微生物學(xué)通報，2011，38（6）：928-933

XU JL ZHANGGX，XUMY，et al Research progress on reuse offood waste with microbial technology [J] Microbiology China. 2011，38 （6）： 928-933 （in Chinese）

[3]THATOI H.BEHERA B c.MISHRA R R.et al Biodiversity andbiotechnological potential of microorganisms froln mangroveecosVstems：A revieW [J] Annals of Microbiology，2013，63（1）：1-19

[4]朱永光，楊柳，張火云，等微生物菌劑的研究與開發(fā)現(xiàn)狀[J]四川環(huán)境、2004. 23（3）：5-8，12

ZHU Y G，YANG L， ZHANG H Y，et al Progress of research anddevelopinent of microorganisms agents for bioaugmentation[J]Sichuan Environment. 2004. 23（3） 58.12（inChinese）

[5]李靜，譚月臣，洪劍明固定化微生物技術(shù)處理廢水[J]安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)、2010. 38（25）：13981-13983

LI J， TAN Y C HONG J M Use of microorgamsm immobilizationteclInology in wastewater treatment [J] Journal ofAnhui AgriculturalSciences. 2010. 38 （25） 13981-13983（mChinese）

[6] 張隴利，劉青，徐智，等復(fù)合微生物菌劑對污泥堆肥的作用效果研究[J]環(huán)境工程學(xué)報，2008，2（2）：266-269

ZHANG L L，LIU Q， XU Z， et al Research on effect of compoundmicrobial inoculant on sewage sludge composting[J]ChineseJournal of Environmental Engineering，2008，2（2）：266-269. （inChinese）

[7]勾長龍，高云航，劉淑霞，等微生物菌劑對堆肥發(fā)酵影響的研究進(jìn)展[J]湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013. 52（6）：1244-1247

GOU C L，GAO Y H，LIU S X，et aI Investigation and applicationprogress of inoculating microbes on aerobic composting ofinanure [J] Hubei Agriculturol Sciences. 2013. 52（6）：12441247. （in Chinese）

[8] 官贊贊，顧錫慧，需太平，等煉油廢水COD降解菌固態(tài)菌劑的制各及性能考察[J]工業(yè)水處理，2016. 36 （2）：75-78

GUANYY，GUX H. LEI T P，et al Study on the preparation andperformances of solid bacteria agent of COD degrading bacteria ofrefmerv wastewater [J] Industrial Water Treatment. 2016. 36（2）7578 （in Chinese）

[9] 王微，李圓萍，謝惠玲，等銅綠假單胞菌菌劑載體的篩選[J]福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2016. 45 /3）：325-330

WANG W. LI Y P，XIE H L，et al Screening of canier forPseudomonos aeruginosa bacterial agent EJl. Jonrnal of FujianAgriculture and Forestrv university（Notural Science Ed7tion）. 2016，45 （3） 325-330. （in Chinese）

[IO]趙旭，王改蘭，陳春玉，等谷糠和堆肥作為微生物菌劑載體的研究[J]安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015. 43（ 14）：179-180. 223

ZHAO X. WANG G L，CHEN C Y. et al.Studv of bran and compostas a carrier for microbial inoculants [J] Journal ofAnhui AgriculturalSciences. 2015. 43（ 14）： 179-180. 223. （in Chinese）

[11]高書鋒，劉惠知，胡新旭，等畜禽用凝結(jié)芽孢桿菌菌劑制備工藝的初步研究[J]飼料工業(yè)，2012. 33 （13）：37-40

GAO S F，LIU H Z，HU X X. et al Preliminarv researches onpreparation techology of Bacillus coagulan strain applied toanimal [J] Feedlndustry. 2012. 33（ 13）：37-40.（ in Chinese）

[12]李娟，張盼月，高英，等麥飯石的理化性能及其在水質(zhì)優(yōu)化中的應(yīng)用[J]環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2008. 31 （10）：63-66. 75

LI J， ZHANG P Y. GAO Y. et al_ Overview of Maifanshi： its physi-cheinical propenies and nutritious function in drinking water [J]Environrnental Science&Technology， 2008.3 l（10） 6366. 75（ in Chinese）

[13]陳麗紅，張翔凌，何春艷，等Zn-LDHs覆膜改性麥飯石對Cd（ Il）吸附性能及其作用機理研究[J]環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2019. 39 （12）：4004-4014

CHEN L H，ZHANG X L，HE C Y. et al' Adsorption behavior andmechanisms for Cd（ll） by modified maifanite coated with Zn-LDHs [J] Acto Scientiae Circumstontiae. 2019. 39（12）：40044014.（ in Chinese）

[14]陳琳荔，鄒華改性麥飯石對水中氮磷的去除[J]食品與生物技術(shù)學(xué)報、2015. 34 （3）：283-290

CHEN L L，ZOU H Experimental study on removal of ammoniumand phosphate in simulation river water by modified Maifan tone [J]Journal of Food Science and Biotechnology. 2015. 34 （3）：283290. （in Chinese）

[15]張琪枯草芽孢桿菌固定化載體的改性條件及處理模擬污水[D]哈爾濱：哈爾濱理工大學(xué)，2014

ZHANG O The modified conditions of Bocillus subtilis immobilizedcanier and the treatment of simulated sewage[D]. Harbin： HarbinUniversity of Science and Teclrnology， 2014. （in Chinese）

[16]陳龍軍，林陳強，張慧，等納豆芽胞桿菌Bacilius matto菌劑載體的篩選[J]福建農(nóng)業(yè)學(xué)報、2018. 33（ 10）：1104-1107

CHEN L J，LIN C Q，ZHANG H， et al Selection of carrier for driedBocillus natto [J]. Fujian Journol of Agricultural Sciences. 2018，33（ lO） 1104-1107. （in Chinese）

[17]常金梅，蔡芷荷，吳清平，等菌種冷凍干燥保藏的影響因素[J]微生物學(xué)通報，2008. 35 （6）：959-962

CHANG J M. CAI Z H，WU Q P，et al Influencing factors to freeze-drying preservation of culture[J]. Microbiology. 2008. 35 （6）：959-962（ in Chinese）

（責(zé)任編輯：吳宇琳）

收稿日期：202007-22初稿：2021-07-02修改稿

作者簡介：陳龍軍（ 1983-），男，碩士，助理研究員，主要從事微生物菌劑、酶工程及發(fā)酵工程研究（E-mail：monkeyirene@163com）

通信作者：陳濟琛（ 1964-），男，研究員，主要從事微生物菌劑研究（E-mail： chenjichen2001@163 com）

基金項目：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院探索創(chuàng)新項目（ AA2018—13）;福建省科技計劃區(qū)域發(fā)展項日（2019Y3005）;福建省科技計劃公益類專項（2018Rl022—

7）、（2019Rl025-4）：圍家重點研發(fā)計劃項目（2018YFD0200706）