謝建軍，曾廣豐，丁博，王璐，侯穎燁，陳文銳，王志元，李菊

（1.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣州 510623； 2.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣州 511436)

大豆及其制品是我國(guó)人民膳食結(jié)構(gòu)中重要的組成部分，其富含植物蛋白質(zhì)、微量元素和多種維生素等成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［1］。大豆榨油后產(chǎn)生的豆粕也是我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)畜禽飼料的重要來(lái)源［2］。然而當(dāng)前我國(guó)本土生產(chǎn)的大豆產(chǎn)量已經(jīng)不能滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需要，每年都要進(jìn)口大量大豆以填補(bǔ)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的缺口。特別是近兩年，中國(guó)大豆進(jìn)口量穩(wěn)居世界第一，2019 年我國(guó)進(jìn)口大豆8 851 萬(wàn)噸，2020 年全年累計(jì)進(jìn)口大豆10 032.82 萬(wàn)噸，同比增幅為11.7%［3-5］。我國(guó)進(jìn)口大豆的主要國(guó)家是巴西、阿根廷、美國(guó)和加拿大等國(guó)［5］。2017 年，我國(guó)進(jìn)口大豆總量的53.3%來(lái)自巴西，34.4%來(lái)自美國(guó)。2018 年4 月中美爆發(fā)了貿(mào)易爭(zhēng)端，我國(guó)開(kāi)始對(duì)進(jìn)口來(lái)自美國(guó)的大豆等農(nóng)產(chǎn)品征收25%的關(guān)稅，懲罰與制裁美國(guó)來(lái)源的大豆等農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易商［6］。受到中美貿(mào)易摩擦影響，我國(guó)進(jìn)口大豆來(lái)源發(fā)生劇烈變化，2018 年我國(guó)進(jìn)口大豆中巴西大豆占進(jìn)口大豆總量的75.1%，美國(guó)大豆占比下降至18.9%［7］。美國(guó)產(chǎn)大豆是否通過(guò)第三國(guó)逃避關(guān)稅制裁進(jìn)入我國(guó)，對(duì)進(jìn)入我國(guó)的大豆的產(chǎn)地溯源問(wèn)題就變得尤其重要。

氫、氧、碳、氮、硫等穩(wěn)定同位素比值具有強(qiáng)大溯源、示蹤能力，近30 年來(lái)，穩(wěn)定同位素分析技術(shù)已在食品、考古、環(huán)境等領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足發(fā)展和應(yīng)用［8］，特別是在食品的真假、摻偽和產(chǎn)地溯源方面，如葡萄酒、飲料、蜂蜜、咖啡等成功應(yīng)用［9-16］，解決了部分棘手的食品真假及產(chǎn)地溯源問(wèn)題。在大豆及其制品的摻偽、產(chǎn)地溯源等領(lǐng)域，近年來(lái)也有部分學(xué)者進(jìn)行了研究［17-19］。而利用元素分析-同位素比質(zhì)譜儀（EA-IRMS）技術(shù)，測(cè)定大豆水溶性蛋白質(zhì)的內(nèi)源性穩(wěn)定同位素δ13C、δ15N、δ18O 和δ2H 值來(lái)進(jìn)行進(jìn)口大豆的產(chǎn)地溯源尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

筆者利用IRMS 技術(shù)測(cè)定大豆水溶性蛋白質(zhì)的內(nèi)源性穩(wěn)定同位素δ13C、δ15N、δ18O 和δ2H 值，并結(jié)合數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，研究探討了大豆產(chǎn)地溯源鑒別方法，構(gòu)建了識(shí)別準(zhǔn)確率高的大豆產(chǎn)地溯源鑒定模型?？蔀槲覈?guó)海關(guān)對(duì)特定貿(mào)易國(guó)實(shí)施特殊關(guān)稅措施提供有力的技術(shù)支撐，有效防止和打擊特定國(guó)家的大豆通過(guò)第三國(guó)轉(zhuǎn)運(yùn)出口至我國(guó)的非法行為，從而維護(hù)國(guó)家利益。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀：Delta V 型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

真空冷凍干燥機(jī)：Alpha 1-2LD PLUS 型，德國(guó)Christ 公司。

粉碎機(jī)：JL064 型，上海嘉定糧油有限公司。

超純水儀：Milli-Q Elix-advantage A10 型，美國(guó)密理博公司。超聲儀：SW 30H 型，瑞士SONO SWISS 公司。高速冷凍離心機(jī)：SIGMA 3-30KS 型，德國(guó)西格瑪離心機(jī)公司。

電子分析天平：Sartorius BT 223S 型，分度值為0.001 g，德國(guó)賽多利斯公司。

He 氣（載氣）、CO2標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)狻O 標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)?、H2標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)?、N2標(biāo)準(zhǔn)參考?xì)猓杭兌龋w積分?jǐn)?shù)）均大于99.999 5%，空氣化工產(chǎn)品(中國(guó))投資有限公司。

超濾離心管：3K，美國(guó)密理博公司。

EA-IRMS 用碳、氮同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：IAEA-600咖啡因（δ13C= -27.771‰，δ15N=1.00‰，分別以V-PDB 和空氣中的N 為基準(zhǔn)），天津歐捷科技有限公司。

EA-IRMS 用氫、氧同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：EMA-P1聚酰胺（δ2H= -25.3‰，δ18O=20.99‰，以V-SMOW為基準(zhǔn)），英國(guó)Elemental Microanalysis 公司。

大豆樣品：100 份，分別產(chǎn)自阿根廷（ARG）、美國(guó)（USA）、加拿大（CAN）和巴西（BRA）。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm。

1.2 樣品處理

將樣品直接粉碎制備30 g 大豆粉，稱取1 g 大豆粉，加入10 mL 超純水，超聲30 min 提取水溶性蛋白質(zhì)，以10 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取1 mL上清液加入3K 超濾離心管中，離心分別獲得相對(duì)分子質(zhì)量大于3 kDa 的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，冷凍干燥8 h 以上至全干，獲得固態(tài)蛋白質(zhì)粉末［20-21］。

1.3 EA-IRMS 檢測(cè)方法

用錫杯和銀杯分別包裹1.2 中的固態(tài)蛋白質(zhì)粉末，校正EA-IRMS，分開(kāi)檢測(cè)樣品中穩(wěn)定碳和氮同位素比，以及穩(wěn)定氫和氧同位素比。錫杯包裹的樣品引入元素分析儀的980 ℃高溫燃燒爐，獲得CO2和N2氣體，進(jìn)入穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀主機(jī)檢測(cè)樣品中δ15N 和δ13C 值；銀杯包裹的樣品引入元素分析儀的1 380 ℃高溫裂解爐中，獲得CO 和H2氣體，導(dǎo)入穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜主機(jī)進(jìn)行檢測(cè)樣品中δ2H和δ18O 值。

1.4 同位素比數(shù)值校正

樣品測(cè)定時(shí)，每個(gè)樣品的分析起始階段通入高純CO、H2、N2和CO2作為參考?xì)怏w，然后用已知δ13C、δ15N、δ18O 和δ2H 值的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定參考?xì)怏w的δ值，再以參考?xì)怏w的標(biāo)定δ值為標(biāo)準(zhǔn)，校正樣品中的δ值。數(shù)據(jù)處理及分析均通過(guò)Isodat3.0軟件（美國(guó)賽默飛世爾公司)進(jìn)行。δ13C、δ15N、δ18O 和δ2H 的計(jì)算以δ13C 為例，大豆水溶性蛋白中δ13C 的計(jì)算是基于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)美國(guó)白堊紀(jì)皮狄組層位中的擬箭石化石（V-PDB），按式(1)計(jì)算［22］：

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將樣品中水溶性蛋白質(zhì)中的δ13C、δ15N、δ18O和δ2H 值歸納整理成excel 表格，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件(瑞典Umetrics 公司)中，進(jìn)行主成分分析（PCA）與正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA），獲得不同產(chǎn)地大豆同位素分布規(guī)律，從而構(gòu)建大豆產(chǎn)地溯源的同位素鑒別模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 EA-IRMS 色譜圖

同位素質(zhì)譜不同于常規(guī)測(cè)定樣品中目標(biāo)物相對(duì)分子質(zhì)量的有機(jī)質(zhì)譜，它是通過(guò)間接檢測(cè)CO2、H2、CO、N2小分子化合物來(lái)確定碳、氫、氧、氮的同位素豐度比。通過(guò)CO2目標(biāo)氣體檢測(cè)樣品的δ13C值，以H2目標(biāo)氣體檢測(cè)樣品的δ2H，以CO 目標(biāo)氣體檢測(cè)樣品的δ18O，以N2目標(biāo)氣體測(cè)定樣品的δ15N。樣品同位素比色譜圖如圖1～圖4 所示。

圖1 大豆水溶性蛋白質(zhì)δ 15N 的EA-IRMS 色譜圖

圖2 大豆水溶性蛋白質(zhì)δ 13C 的EA-IRMS 色譜圖

圖3 大豆水溶性蛋白質(zhì)δ 2H 的EA-IRMS 色譜圖

圖4 大豆水溶性蛋白質(zhì)δ 18O 的EA-IRMS 色譜圖

2.2 大豆水溶性蛋白質(zhì)的穩(wěn)定同位素比值

采用EA-IRMS 同位素比質(zhì)譜儀分析測(cè)定大豆水溶性蛋白質(zhì)的δ13C、δ15N、δ18O 和δ2H 值見(jiàn)表1。大豆屬于C3植物，根據(jù)文獻(xiàn)［23］，C3植物的δ13C 值為-20‰～-35‰(平均值為-26‰)。本研究大豆水溶性蛋白質(zhì)測(cè)定的δ13C 值為-24.675‰～-29.490‰，利用t分布統(tǒng)計(jì)學(xué)分析60 種大豆樣品水溶性蛋白質(zhì)δ13C 平均值為-26.931‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.995%。由此可知，本方法檢測(cè)大豆水溶性蛋白質(zhì)δ13C 值與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)基本一致。同時(shí)，由表1 可知，測(cè)定的大豆水溶性蛋白質(zhì)δ15N值為-1.595‰～2.537‰，平均值為0.320‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.046%；δ18O 值為15.749‰～25.127‰，平均值為19.503‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.250%；δ2H 值為-33.504‰～-118.697‰，平均值為-83.534‰，標(biāo)準(zhǔn)偏差為21.365%。

表1 大豆水溶性蛋白質(zhì)的δ 13C、δ 15N、δ 18O 和δ 2H 值

續(xù)表1

2.3 統(tǒng)計(jì)分析方法比較

利用SIMCA14.1 軟件對(duì)測(cè)定的大豆水溶性蛋白質(zhì)δ13C、δ15N、δ18O 和δ2H 值進(jìn)行多元變量統(tǒng)計(jì)分析，分別建立PCA 和OPLS-DA 兩種統(tǒng)計(jì)分析方法的大豆產(chǎn)地溯源鑒別模型，如圖5 和圖6 所示（橢圓形區(qū)域?yàn)镠otelling T2 檢驗(yàn)，95%置信區(qū)間）。

圖5 大豆水溶性蛋白質(zhì)δ 13C、δ 15N、δ 18O 和δ 2H 的PCA 鑒別模型

圖6 大豆水溶性蛋白質(zhì)δ 13C、δ 15N、δ 18O 和δ 2H 的OPLS-DA 鑒別模型

PCA 溯源鑒定模型結(jié)果顯示，利用大豆水溶性蛋白質(zhì)中的δ13C、δ15N、δ18O 和δ2H 值可區(qū)分四個(gè)國(guó)家的大豆樣品。構(gòu)建OPLS-DA 大豆產(chǎn)地溯源鑒定模型獲得大豆中水溶性蛋白質(zhì)的4 個(gè)變量δ13C、δ15N、δ18O 和δ2H 對(duì)產(chǎn)地區(qū)分模型的貢獻(xiàn)度用VIP值評(píng)定。結(jié)果表明，δ15N 在產(chǎn)地溯源模型中對(duì)產(chǎn)地溯源的貢獻(xiàn)最大，其次是δ2H 和δ18O，δ13C 的貢獻(xiàn)最低，其VIP 值依次為1.069，1.045，1.035，0.834。對(duì)比分析大豆產(chǎn)地溯源的兩種統(tǒng)計(jì)分析方法的模型鑒定準(zhǔn)確率，結(jié)果表明，OPLS-DA 模型分析結(jié)果顯著，建立的識(shí)別模型對(duì)美國(guó)、巴西和阿根廷產(chǎn)大豆的識(shí)別準(zhǔn)確率均為100%，對(duì)加拿大產(chǎn)大豆的識(shí)別準(zhǔn)確率為90%；PCA 識(shí)別模型對(duì)美國(guó)和阿根廷產(chǎn)大豆的識(shí)別準(zhǔn)確率均為80%，對(duì)巴西和加拿大產(chǎn)大豆的識(shí)別準(zhǔn)確率均為90%，因此最終選擇OPLS-DA統(tǒng)計(jì)方法建立的模型進(jìn)行大豆產(chǎn)地溯源識(shí)別分析。

2.4 大豆產(chǎn)地鑒定模型建立

分別對(duì)美國(guó)與其它國(guó)家大豆水溶性蛋白質(zhì)δ13C、δ15N、δ18O 和δ2H 值采用OPLS-DA 建立兩兩國(guó)家同位素產(chǎn)地溯源鑒定模型，結(jié)果如圖7～圖9 所示（橢圓形區(qū)域?yàn)镠otelling T2檢驗(yàn)，95%置信區(qū)間）。

圖7 美國(guó)-加拿大大豆產(chǎn)地溯源OPLS-DA 鑒別模型

圖8 美國(guó)-巴西大豆產(chǎn)地溯源OPLS-DA 鑒別模型

圖9 美國(guó)-阿根廷大豆產(chǎn)地溯源OPLS-DA 鑒別模型

圖7～圖9 結(jié)果表明，所建立的同位素產(chǎn)地溯源鑒定模型識(shí)別準(zhǔn)確率達(dá)到100%，應(yīng)用該方法可準(zhǔn)確鑒別美國(guó)與其他國(guó)家大豆產(chǎn)地。

2.5 大豆產(chǎn)地鑒定模型驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述模型的可靠性，選用四個(gè)國(guó)家各10 份非建模大豆樣品，提取其中的水溶性蛋白質(zhì)，測(cè)定δ13C、δ15N、δ18O 和δ2H 值，分別帶入已建立的OPLS-DA 兩兩國(guó)家識(shí)別模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表2。盲樣驗(yàn)證結(jié)果表明，除了加拿大產(chǎn)大豆中有1 份被誤判為美國(guó)產(chǎn)外，其他3 個(gè)國(guó)家盲樣均可準(zhǔn)確識(shí)別，識(shí)別準(zhǔn)確率為100%。

表2 OPLS-DA 識(shí)別模型的盲樣驗(yàn)證

3 結(jié)語(yǔ)

建立了基于EA-IRMS 測(cè)定大豆水溶性蛋白質(zhì)δ13C、δ15N、δ18O 和δ2H 的OPLS-DA 大豆產(chǎn)地溯源模型。結(jié)果表明，美國(guó)與加拿大、阿根廷、巴西產(chǎn)的大豆在建立的兩兩識(shí)別模型中可準(zhǔn)確鑒別，識(shí)別準(zhǔn)確率均可達(dá)100%。該方法和所構(gòu)建的模型準(zhǔn)確可靠，可有效防止和打擊特定國(guó)家的大豆通過(guò)第三國(guó)轉(zhuǎn)運(yùn)出口至我國(guó)的非法行為，維護(hù)國(guó)家利益。