魯素雅，邢海艷，吳義春，金鵬

（淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，淮安 223005)

防曬類化妝品因具有保護(hù)人體皮膚免受紫外線輻射損傷的功效而受到廣大消費(fèi)者的青睞，其主要活性成分為防曬劑。防曬劑是指利用光的吸收、反射或散射作用，以保護(hù)皮膚免受特定紫外線所帶來(lái)的傷害或?yàn)楸Ｗo(hù)產(chǎn)品本身而在化妝品中加入的物質(zhì)。按防曬機(jī)制不同，防曬劑可分為物理防曬劑和化學(xué)防曬劑兩類。防曬劑對(duì)皮膚有保護(hù)作用，但是使用過(guò)量也會(huì)影響皮膚健康，如過(guò)敏、泛紅、光敏、發(fā)炎等［1-4］?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》 2015 年版（簡(jiǎn)稱《技術(shù)規(guī)范》）中規(guī)定了27 種準(zhǔn)用防曬劑，其中包括2 種物理防曬劑和25 種化學(xué)防曬劑［5-6］。二苯甲酮類化合物是一類具有紫外吸收功能的高分子材料，其吸收波長(zhǎng)范圍廣，同時(shí)具有防長(zhǎng)波紫外線（UVA）和中波紫外線（UVB）的功能，是目前國(guó)內(nèi)外常用的防曬劑。但二苯甲酮類也是環(huán)境激素，會(huì)干擾生物體和人體內(nèi)分泌，造成精子數(shù)量減少，并導(dǎo)致不孕癥等不良反應(yīng)［7-10］，因此《技術(shù)規(guī)范》中明確規(guī)定了可作為防曬劑使用的品種和最大使用濃度，其中二苯酮-3、二苯酮-4／5 是準(zhǔn)用防曬劑，最大使用濃度分別為10%和5%，二苯酮-5 是二苯酮-4 的鈉鹽形式，實(shí)際使用以二苯酮-4 計(jì)算，并且僅規(guī)定了二苯酮-2的檢測(cè)方法并用于此類化合物的檢測(cè)與監(jiān)管，而對(duì)化妝品中其它二苯甲酮類化合物含量的測(cè)定則未作規(guī)定，因此不利于對(duì)此類化合物的監(jiān)管和產(chǎn)品質(zhì)量控制［11］。

高效液相色譜（HPLC）法是化妝品檢驗(yàn)中較常使用的方法，其檢測(cè)范圍廣，對(duì)樣品要求較低，對(duì)極性和非極性化合物均能達(dá)到有效的分離。唐娜等［12］采用高效液相色譜法測(cè)定了化妝品中山梨酸和脫氫乙酸；肖庚鵬等［13］采用柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定了化妝品中?；撬?；陳靜等［14］采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定了化妝品中8 種防腐劑；楊淡梅等［15］采用高效液相色譜法同時(shí)了檢測(cè)染發(fā)類化妝品中16 種禁用著色劑。筆者通過(guò)對(duì)樣品處理及HPLC條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了同時(shí)測(cè)定化妝品中9 種二苯甲酮類紫外吸收劑的高效液相色譜法，為市場(chǎng)監(jiān)管與檢測(cè)提供數(shù)據(jù)與方法支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters 2695／2998 型，美國(guó)沃特世公司。

超聲清洗儀：KQ-250DV 型，昆山市超聲儀器有限公司。

超純水機(jī)：美國(guó)密理博公司。

有機(jī)系針筒式微孔濾膜：0.45 μm，上海安譜公司。

電子天平：XS205D 型，感量為0.01 mg，美國(guó)梅特勒公司。

甲醇、乙腈、四氫呋喃：均為色譜純，德國(guó)默克公司。

高氯酸：分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司?；瘖y品樣品：共15 批，市購(gòu)。

二苯甲酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：基本信息見(jiàn)表1。

表1 二苯甲酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基本信息

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm×2.1mm，5 μm，美國(guó)沃特世公司）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水溶液；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表2；流量：1.0 mL／min，進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：322 nm。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3 溶液配制

9 種二苯甲酮標(biāo)準(zhǔn)溶液：1.0 mg／mL，分別稱取9 種二苯甲酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（BP-1、BP-2、BP-3、BP-4、BP-6、BP-7、BP-8、BP-10、BP-12）各10 mg（精確至0.01 mg），分別置于9 只10 mL 容量瓶中，分別加入乙腈溶解并稀釋至標(biāo)線，混勻。

9 種二苯甲酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別移取BP-1、BP-2、BP-3、BP-6、BP-10、BP-12 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液 各2.5 mL，BP-4、BP-7、BP-8 標(biāo)準(zhǔn)溶液各5.0 mL，置于同一只100 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至標(biāo)線，混勻，配制成BP-1、BP-2、BP-3、BP-6、BP-10、BP-12 的質(zhì)量濃度均為25 μg／mL，BP-4、BP-7、BP-8 的質(zhì)量濃度均為50 μg／mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

9 種二苯甲酮系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：依次移取9種二苯甲酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL，分別置于6 只10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至標(biāo)線，混勻，配制成BP-1、BP-2、BP-3、BP-6、BP-10、BP-12 的質(zhì)量濃度均分別為0.25、0.5、1.25、2.5、5、12.5 μg／mL，BP-4、BP-7、BP-8 的質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、2.5、5、10、25 μg／mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品處理

稱取樣品約1.0 g，置于50 mL 具塞試管中，加入30 mL 乙腈，超聲提取30 min，冷卻，用乙腈稀釋至50 mL，混勻，靜置，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑選擇

稱取3 份陰性樣品，各1.0 g，分別加入1.3 中的9 種二苯甲酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL，分別選取乙腈、四氫呋喃、甲醇-四氫呋喃-水-高氯酸混合溶劑（體積比為250∶450∶300∶0.2）為提取溶劑，按照1.4方法處理樣品，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算不同溶劑提取時(shí)9 種二苯甲酮的回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可知，以乙腈為提取溶劑時(shí)，樣品的回收率較高，重復(fù)性好；用四氫呋喃為提取溶劑時(shí)，各組分回收率均偏低；采用混合溶劑提取時(shí)測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較差，故選取乙腈作為提取溶劑。

表3 不同溶劑提取時(shí)9 種二苯甲酮的回收率 %

2.2 取樣量選擇

分別稱取陰性樣品0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 g，各加入1.3 中的9 種二苯甲酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL，按照1.4 方法處理樣品，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)樣測(cè)定，比較不同取樣量時(shí)樣品的加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同取樣量時(shí)9 種二苯甲酮的回收率 %

由表4 可知，不同取樣量對(duì)分析結(jié)果影響不明顯。采用IBM SPSS Statistics 22 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)［16］，t值均大于0.05，故不同取樣量對(duì)樣品提取回收率的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t≥0.05）。由于化妝品基質(zhì)較復(fù)雜，為避免由于取樣量太少使化合物檢測(cè)量小于檢出限，或取樣量過(guò)大污染儀器與色譜柱，選擇取樣量為1.0 g。若樣品中化合物檢出濃度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍可適當(dāng)稀釋后再檢測(cè)。

2.3 色譜條件

2.3.1 色譜柱選擇

分別比較Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、資 生 堂Capcell PAK C8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、資 生 堂Capcell PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、資生堂Capcell PAK CR柱（150 mm×2.0 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）5 種不同型號(hào)的色譜柱對(duì)9 種二苯酮類紫外吸收劑的分離效果。結(jié)果表明，C8色譜柱不能將9 種化合物有效分離；使用CR色譜柱分離時(shí)，前8種化合物出峰時(shí)間比較密集；采用C18色譜柱時(shí)，9 種化合物均能有效分離，其中采用Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）分離時(shí)，峰型尖銳，各化合物響應(yīng)較高，故選取Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）對(duì)9 種二苯酮類紫外吸收劑進(jìn)行分離。

2.3.2 流動(dòng)相選擇

分別選擇乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水作為流動(dòng)相對(duì)9 種二苯甲酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行梯度洗脫，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可以看出，由于甲醇洗脫能力小于乙腈，各組分出峰較晚且集中，以乙腈-水和甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，二苯酮-4／5 峰型不尖銳，與以乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)相比保留時(shí)間變化較大。結(jié)合3組流動(dòng)相梯度洗脫出峰情況及使用乙腈作提取溶劑，最終選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相。

圖1 不同流動(dòng)相時(shí)9 種二苯甲酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

分別考察了9 種二苯酮類紫外吸收劑在210～400 nm 的特征吸收峰分布情況。結(jié)果顯示，9種二苯酮類化合物在210～350 nm 紫外波長(zhǎng)范圍內(nèi)均有特征吸收，其中二苯酮-4 和二苯酮-7 的響應(yīng)較低，故選擇二苯酮-4 和二苯酮-7 響應(yīng)相對(duì)較高的322 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

分別稱取防曬噴霧、防曬霜、隔離霜、粉底液4種空白基質(zhì)樣品各1.0 g，按照1.4 樣品處理方法，分別制備防曬噴霧、防曬霜、隔離霜、粉底液空白基質(zhì)溶液，分別加入1.3 中的9 種二苯甲酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL 配制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)樣測(cè)定，以二苯甲酮的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程。以4 種基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率（k1）與用乙腈配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（k2）進(jìn)行比較，斜率的比值見(jiàn)表5。

表5 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與乙腈配制標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值

由表5 可知，測(cè)定的斜率比值為0.985～1.068，說(shuō)明該提取方法對(duì)4 種不同基質(zhì)提取后，基質(zhì)效應(yīng)較小，可直接采用乙腈配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析。

2.5 線性方程、檢出限與定量限

在1.2 儀器工作條件下，對(duì)1.3 中的9 種二苯甲酮系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測(cè)定，以二苯甲酮的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

另取陰性樣品1.0 g，分別加入不同濃度的9 種二苯甲酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4 方法處理樣品，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，以3 倍信噪比（S／N）對(duì)應(yīng)的二苯甲酮的含量為檢出限，以10 倍信噪比對(duì)應(yīng)的二苯甲酮的含量為定量限。9 種二苯甲酮類紫外吸收劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限表6。

表6 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

取陰性樣品1.0 g，分別加1.3 中的9 種二苯甲酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、5.0 mL，按1.4 方法處理樣品，制備成3 個(gè)不同濃度水平的加標(biāo)樣品溶液，每個(gè)濃度點(diǎn)平行制備6 份，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表7

由表7 可知，9 種二苯甲酮類紫外吸收劑的加標(biāo)回收率為89.84%～112.04%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2%～7.7%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

按所建方法，對(duì)市售的15 批化妝品樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表9。由表9 可知，有2 批樣品檢出二苯酮-3，含量分別為1.53%和5.95%，未超出10%的使用限度；有1 批樣品檢出禁用物質(zhì)二苯酮-10，含量為12.6 μg／g。在15 批樣品中均未發(fā)現(xiàn)有干擾目標(biāo)物測(cè)定的雜質(zhì)峰。代表性的防曬霜樣品的色譜圖如圖2 所示，從圖中可知，化妝品中基質(zhì)未干擾目標(biāo)物的測(cè)定。

表9 種化妝品中二苯酮類紫外吸收劑檢測(cè)結(jié)果

圖2 防曬霜樣品色譜圖

3 結(jié)語(yǔ)

建立了化妝品中9 種二苯甲酮類紫外吸收劑同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜法。以乙腈為溶劑，對(duì)樣品進(jìn)行超聲提取，以C18色譜柱將目標(biāo)物分離，用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)。該方法流動(dòng)相配制簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，分離效果好，基質(zhì)干擾少，滿足化妝品中多種二苯甲酮類紫外吸收劑同時(shí)測(cè)定。