火麻油中五種大麻素的HPLC同時(shí)檢測

孫冬梅，蘭 韜 ，云振宇，于聰聰，初 僑，張維冰

（1.華東理工大學(xué)，上海 200237；2.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京 100191）

火麻油是以工業(yè)大麻籽冷榨產(chǎn)生的油脂類產(chǎn)品，其含有高達(dá)80%的多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFA）[1]，ω-6/ω-3的比例為3:1，這與歐洲食品安全局的建議[2]一致?；鹇橛蜖I養(yǎng)豐富，長期食用可有效補(bǔ)充人體必需營養(yǎng)素α-亞麻酸，潤燥滑腸、有益于心腦血管健康，具有延年益壽的功效[2]。同時(shí)其中含有Δ9-四氫大麻酚（Δ9 Tetrahydrocannabinol，THC）、大麻二酚（Cannabidiol，CBD）、大麻酚（Cannabinol，CBN）、四氫大麻酚酸（Tetrahydro-cannabinolic Acid，THCA）、大麻二酚酸（Cannabidiolic acid，CBDA）等大麻酚類物質(zhì)。除THC具有影響中樞神經(jīng)的作用而受到管控外，CBD、CBN等物質(zhì)也具有降低血脂、血壓、血糖等保健功效[3-5]，CBD在醫(yī)學(xué)上對(duì)癲癇[6]、抑郁癥[7]、多發(fā)性硬化癥[8]等疾病也具有明顯的治療作用。

由于火麻油的原料及制備工藝不同，其中THC、CBD、CBDA、CBN、THCA等大麻素的含量也存在很大差異[9-11]。隨著工業(yè)大麻食品的日益普及，美國、德國、瑞士、比利時(shí)、歐洲工業(yè)大麻協(xié)會(huì)（European Industrial Hemp Association，EIHA）等許多國家相繼發(fā)布了政策和法規(guī)，對(duì)火麻油等消費(fèi)產(chǎn)品中THC的上限進(jìn)行了規(guī)定[12]。我國也存在大量火麻油類產(chǎn)品，卻尚未出臺(tái)關(guān)于工業(yè)大麻食品中THC、CBD等大麻素的限量標(biāo)準(zhǔn)以及檢測標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的缺失導(dǎo)致無法把控產(chǎn)品質(zhì)量，造成市場上火麻油產(chǎn)品良莠不齊。為了保證火麻油類食品的安全性，同時(shí)為了兼顧火麻油類食品的功能性，需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的火麻油中幾種常見大麻酚類物質(zhì)的檢測方法，為后續(xù)建立相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，以及進(jìn)行相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測奠定基礎(chǔ)。

由于大麻素的結(jié)構(gòu)相似以及這些物質(zhì)之間存在的轉(zhuǎn)換關(guān)系[13-15]，如圖1所示，這對(duì)分析方法的準(zhǔn)確性提出了較高要求。目前報(bào)道了大量針對(duì)不同基質(zhì)中多種大麻素的檢測方法，主要檢測手段包括GCFID[16]、GC-MS[17]、HPLC-DAD[18-21]、HPLC-MS[22-24]

圖1 5種大麻素結(jié)構(gòu)式及相互轉(zhuǎn)換圖Fig.1 Structural formulas and mutual conversion diagrams of 5 cannabinols

等。由于GC會(huì)在加熱的過程中使一些大麻酚酸類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為大麻素類物質(zhì)，不利于大麻酚酸類物質(zhì)的檢測，所以在同時(shí)檢測大麻素和大麻酚酸類物質(zhì)時(shí)通常使用HPLC的方法。研究人員在早期通常采用常規(guī)的C18填料對(duì)多種大麻素進(jìn)行分離分析。隨著一些特殊的選擇性固定相的誕生，研究者開始嘗試用這些新穎的固定相對(duì)這些大麻素進(jìn)行選擇性地分離分析，并取得了較好的分離效果[25-26]。如H?dener等[27]基于C8核殼結(jié)構(gòu)固定相對(duì)干燥大麻植株中THC、THCA、CBD、CBDA、CBN五種大麻素進(jìn)行了分離。Ciolino等[28]采用芳基改性的C18固定相，發(fā)展了工業(yè)大麻相關(guān)產(chǎn)品中11種大麻素的檢測方法，都取得了較好的分離選擇性。作為工業(yè)大麻相關(guān)產(chǎn)品中最常見的幾種大麻素，THC、THCA、CBD、CBDA、CBN被研究的最多。而針對(duì)這幾種常見的大麻素，不需要使用特殊選擇性的固定相，使用常規(guī)的C18固定相即可實(shí)現(xiàn)良好的分離效果。

為了發(fā)展一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的、普適性好的火麻油中THC、THCA、CBD、CBDA、CBN等大麻素的檢測方法，本文廣泛采集了國內(nèi)山西、廣西、陜西、黑龍江4個(gè)不同產(chǎn)地的火麻油，并根據(jù)不同產(chǎn)地火麻油基質(zhì)的特點(diǎn)，通過優(yōu)化前處理?xiàng)l件和色譜條件，發(fā)展了一種普適、簡單、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的火麻油中五種大麻素的檢測方法，并通過方法學(xué)驗(yàn)證，實(shí)現(xiàn)檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化，為相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大麻素標(biāo)準(zhǔn)品：CBDA、CBD、CBN、THC、THCA標(biāo)準(zhǔn)品（1 mg/mL，1 mL） 美國Cerilliant公司；甲醇、乙腈 色譜純，德國Merck公司；異丙醇 色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；4個(gè)產(chǎn)地火麻油（山西、陜西、廣西、黑龍江） 網(wǎng)購。

iChrom5100分析型國產(chǎn)液相色譜儀（配DAD檢測器）、Supersil-ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） 大連依利特分析儀器有限公司；Thmorgan-VM200型渦旋振蕩器 托摩根生物科技有限公司；HITACHI-CF15RXII離心機(jī) 日立公司；Sartorius分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；ELGA純水儀 北京誠驛恒儀科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 流動(dòng)相 流動(dòng)相A為純水，為實(shí)驗(yàn)室純水儀自制，電導(dǎo)率為18.2 MΩ，使用前經(jīng)水相濾膜抽濾，超聲脫氣。

流動(dòng)相B為乙腈（色譜純），使用前經(jīng)有機(jī)相濾膜抽濾，超聲脫氣。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液 混和標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取CBDA

（1 mg/mL）、CBD（1 mg/mL）、CBN（1 mg/mL）、THC（1 mg/mL）、THCA（1 mg/mL）標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入混合溶劑（甲醇:異丙醇=80:20，v/v）定容，配制成100 μg/mL的5種大麻素混和標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱冷藏保存，有效期為30 d。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 mL分別置于10 mL容量瓶中，用混合溶劑（甲醇:異丙醇=80:20，v/v）定容，配制為質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確到0.001 g）火麻油于10 mL離心管中，加入2.5 mL混合溶劑（甲醇:異丙醇=80:20，v/v），渦旋2 min混勻，超聲提取15 min，提取液以10000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜后待測。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱為Supersil-ODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm），進(jìn)樣體積為10 μL，流速1 mL/min，柱溫：35 ℃，檢測波長為220 nm，流動(dòng)相A相為超純水，流動(dòng)相B相為乙腈，梯度洗脫條件為0～20 min，70%B～90%B；20～22 min，90%B；22～24 min，90%B～70%B；24～30 min，70%B。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將配制好的0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按“1.2.3”的液相色譜條件進(jìn)樣分析，分別以5種化合物的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到5種大麻素的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程。

1.2.4.2 定量限、檢出限 將1.2.1.2的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按“1.2.3”的液相色譜條件測定，測得5種大麻素的峰面積，帶入相應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中。以最低水平標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)組分的3倍平均信噪比為檢出限（LOD），10倍平均信噪比為定量限（LOQ），計(jì)算得本方法的LOD和LOQ。

1.2.4.3 精密度試驗(yàn) 在相同儀器條件下，取1 μg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液, 按“1.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程得出測定濃度值，再計(jì)算測定濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 在相同的儀器條件下，精密稱取0.5g（精確到0.001 g）火麻油6份，按“1.2.2”項(xiàng)下方法操作，將處理好的6份待測液按“1.2.3”色譜條件進(jìn)樣分析，測得5種大麻素峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算測定濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

1.2.4.5 加標(biāo)回收率 準(zhǔn)確稱取陜西產(chǎn)的火麻油0.5 g（精確到0.01 g）12份，編號(hào)1～12，其中1～3號(hào)作為本底，4～6號(hào)加標(biāo)配成0.5 μg/mL待測液，7～9號(hào)加標(biāo)配成1 μg/mL待測液，10～12號(hào)加標(biāo)配成5 μg/mL待測液，按“1.2.2”項(xiàng)下方法操作，將處理好的本底待測液以及低、中、高3種濃度的加標(biāo)樣品經(jīng)HPLC分析，測得峰面積，計(jì)算回收率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)由依利特ichrom5100 workstation處理所得，其他數(shù)據(jù)采用Origin8.5和Excel2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

為盡可能的將待測的五種大麻素類物質(zhì)與火麻油中的基質(zhì)成分的分離，首先對(duì)流動(dòng)相梯度程序進(jìn)行了優(yōu)化。以山西火麻油的甲醇提取液為本底溶液，向其中添加了5 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品，采用兩種不同的流動(dòng)相梯度程序?qū)Ρ镜滓汉图訕?biāo)液分別進(jìn)行了色譜分離，兩種流動(dòng)相梯度程序分別為：程序1：0～20 min，80%B～90%B；20～22 min，90%B；22～24 min，90%B～80%B；24～30 min，80%B。程序2：0～20 min，70%B～90%B；20～22 min，90%B；22～24 min，90%B～70%B；24～30 min，70%B。分離結(jié)果如圖2所示，并通過單標(biāo)法對(duì)峰的歸屬進(jìn)行了確證。結(jié)果表明在梯度程序1下CBD無法與火麻油基質(zhì)成分分離，THC和THCA分離度較差。而經(jīng)過降低初始有機(jī)相的組成，在梯度程序2下，火麻油中各個(gè)峰分離情況較好，且基質(zhì)中雜質(zhì)峰和待測的五種大麻素的色譜峰沒有相互掩蓋，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)都采用梯度程序1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化和方法驗(yàn)證。并且從圖2可以看出，通過調(diào)整流動(dòng)相的比例，改變洗脫條件，能夠?qū)崿F(xiàn)將基質(zhì)中雜質(zhì)峰與被分析物色譜峰分離的效果，降低了雜質(zhì)峰干擾的可能，從而省去對(duì)提取液進(jìn)行凈化處理的步驟，使得操作簡便、耗時(shí)較短。

圖2 兩種梯度程序下5 μg/mL加標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)品的火麻油甲醇提取液樣品色譜圖Fig.2 Chromatograms of the hemp oil methanol extract with a spiked concentration of 5 μg/mL under two different gradient programs

2.2 提取溶劑優(yōu)化

根據(jù)5種大麻素的結(jié)構(gòu)、極性、溶解性等性質(zhì)[29-30]，選擇合適的提取方法和提取溶劑是檢測的重要前提。有較多文獻(xiàn)[26,30]選擇使用甲醇作為提取溶劑，提取火麻油中的大麻酚類物質(zhì)?？紤]到異丙醇可以和水、脂肪類化合物以及較多有機(jī)物都有較好的互溶，并且其閃燃點(diǎn)、爆炸極限等安全性能都較好，對(duì)環(huán)境和人體健康影響較小，常被用于植物提取物的提取。

因此，在儀器及實(shí)驗(yàn)條件相同情況下，本實(shí)驗(yàn)選擇了100%甲醇；甲醇:異丙醇=80:20；甲醇:異丙醇=50:50的3種溶劑，取相同火麻油樣品，向其中添加了5 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品，采用“1.2.2”的樣品提取方式，分別用以上3種溶劑進(jìn)行提取，并測定加標(biāo)回收率，結(jié)果如下表1。從表1中可以看出，添加了異丙醇后，樣品的回收率可以控制在70%～100%之間，其中以甲醇:異丙醇=80:20進(jìn)行提取，結(jié)果具有更好的穩(wěn)定性，可以控制RSD＜5%。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用甲醇:異丙醇=80:20的提取溶劑進(jìn)行提取。

表1 3種不同溶劑提取結(jié)果對(duì)比Table 1 Comparisonof extraction results of three different solvent

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限、檢出限

對(duì)5種大麻素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測定，通過ichrom5100 workstation繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，其線性范圍、相關(guān)系數(shù)、LOD及LOQ如下表2所示。由表中數(shù)據(jù)可知，本方法在0.5～50 μg/mL范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r均＞0.998。經(jīng)計(jì)算，5種大麻素的檢出限（LOD，S/N=3）均在0.10～0.25 mg/kg之間，定量限（LOQ，S/N=10）均在0.33～0.83 mg/kg之間，與國家司法鑒定技術(shù)規(guī)范方法[31]的LOD接近（0.05 ng/mg），但由于該方法使用的是液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法進(jìn)行檢測，而本方法使用常規(guī)的HPLC進(jìn)行檢測，所以本方法在經(jīng)濟(jì)適用的基礎(chǔ)上，檢測靈敏度也具有較強(qiáng)競爭力。

表2 5種大麻素的線性范圍、LOD和LOQTable 2 Linear range, LOD and LOQ of 5 kinds of cannabidiol

2.4 精密度

按照“1.2.4.3”實(shí)驗(yàn)步驟，在1 d內(nèi)平行測定6次1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測得的CBDA、CBD、CBN、THC、THCA五種大麻素的濃度與RSD如下表3所示。由上表數(shù)據(jù)可知，精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD在0.7%～3.9%之間，表明儀器精密度良好，使用該儀器進(jìn)行檢測，可以保證方法的結(jié)果準(zhǔn)確。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（μg/mL）Table 3 Precision test results (μg/mL)

2.5 重復(fù)性

以陜西產(chǎn)的火麻油為樣品，按照“1.2.4.4”實(shí)驗(yàn)步驟，測得平行6組火麻油中CBDA、CBD、CBN、THC、THCA五種大麻素的濃度及RSD如下表4所示。由上表數(shù)據(jù)可知，6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的RSD在1.9%～3.2%之間，表明本方法重復(fù)性較好，結(jié)果準(zhǔn)確性較好。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（μg/mL）Table 4 Repeatability experiment results (μg/mL)

2.6 加標(biāo)回收率

在陜西產(chǎn)的火麻油實(shí)際樣品中添加0.5、1、5 μg/mL的低、中、高三種濃度水平的大麻素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，并計(jì)算回收率，結(jié)果如表5所示。由表中數(shù)據(jù)可知，5種大麻素的回收率在77.1%～103.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤4.7%，表明本方法回收率好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 5 Recovery rate of three different spiked levels (n=3)

2.7 實(shí)際樣品測定

以本方法的提取工藝和色譜條件對(duì)廣西、黑龍江、山西、陜西4個(gè)產(chǎn)地的火麻油樣品進(jìn)行了分離分析，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，4個(gè)產(chǎn)地的火麻油中均或多或少的存在一定量的5種大麻素，這5種大麻素與基質(zhì)中的其他物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了良好的分離，不影響這5種大麻素的定量分析。對(duì)山西、廣西、陜西、黑龍江4個(gè)不同產(chǎn)地的火麻油中5種大麻素含量進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算結(jié)果見表6。實(shí)際樣品分析結(jié)果表明，除山西火麻油中不含CBDA和THCA外，陜西、廣西、黑龍江等3個(gè)產(chǎn)地的火麻油中5種大麻素都有檢出，且具有成癮性的THC的含量均＞3.2 mg/kg，其中陜西火麻油中THC含量甚至高達(dá)11.9 mg/kg。歐盟國家對(duì)工業(yè)大麻食品中特征大麻素THC含量的限定標(biāo)準(zhǔn)為10 mg/kg；2017年，澳大利亞和新西蘭在澳新食品標(biāo)準(zhǔn)法典中修訂了大麻籽及相關(guān)食品標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定火麻油中THC含量不高于10 mg/kg[32]；智利在2016年發(fā)布的通報(bào)中也規(guī)定大麻子食品中THC含量不得超過10 mg/kg。我國廣西壯族自治區(qū)分別于2014、2015、2018年制定火麻油、火麻仁以及火麻糊的地方標(biāo)準(zhǔn)，允許以火麻籽為原料，經(jīng)加工工藝制成的非直接食用的火麻仁添加到食品中[33-35]，但是都未對(duì)其中THC含量進(jìn)行規(guī)定。從目前國內(nèi)4個(gè)產(chǎn)地火麻油的監(jiān)測結(jié)果可以看出，只有陜西火麻油中THC含量為11.9 mg/kg，超過了世界上主流國家對(duì)于工業(yè)大麻食品中THC含量的要求，有一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，有關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測，建議在火麻油標(biāo)準(zhǔn)中增加THC含量的限定指標(biāo)，不應(yīng)超過10 mg/kg。同時(shí)應(yīng)制定相應(yīng)的火麻油中大麻酚素檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，完善監(jiān)管制度以保障食品安全。

表6 不同產(chǎn)地火麻油中5種大麻素含量（mg/kg）（n=3）Table 6 Contents of 5 cannabinols in hemp oil from different producing areas (mg/kg) (n=3)

圖3 4個(gè)產(chǎn)區(qū)火麻油的分離譜圖Fig.3 Chromatogram of hempseed oil from four different regions

3 結(jié)論

大麻籽和大麻籽油相關(guān)產(chǎn)品具有較高的蛋白質(zhì)含量和營養(yǎng)價(jià)值，在消費(fèi)者中很受歡迎，本文建立了一種基于高效液相色譜法的同時(shí)檢測火麻油中5種大麻素的分析方法。通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相配比，優(yōu)化色譜條件實(shí)現(xiàn)被測組分色譜峰與基質(zhì)中雜質(zhì)峰的有效分離，該分析方法操作簡便、耗時(shí)較短、經(jīng)濟(jì)。同時(shí)經(jīng)過精密度實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)等對(duì)本方法的有效性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，本方法的檢出限、定量限、精密度、回收率等結(jié)果均較好，可用于實(shí)際樣品的分析確證，同時(shí)可為相關(guān)檢測方法標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。通過對(duì)國內(nèi)4個(gè)產(chǎn)地的火麻油進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中均含有THC，而且有部分產(chǎn)地火麻油中THC含量超過了世界上主流國家對(duì)于工業(yè)大麻食品中THC含量的要求（10 mg/kg），存在一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，建議在火麻油標(biāo)準(zhǔn)中增加THC含量的限定指標(biāo)，不應(yīng)超過10 mg/kg，同時(shí)制定相應(yīng)的火麻油中大麻素檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制，保障人民群眾健康。