李志英, 李健如

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州 034000)

金屬納米簇是由幾個(gè)或者幾十個(gè)原子組成的相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)體,尺寸小于10 nm，接近電子的費(fèi)米波長(zhǎng)，特有的量子尺寸效應(yīng)使得其在光學(xué)和電學(xué)上具有隨粒徑大小變化而改變的性質(zhì)[1]。相對(duì)于Au和Ag納米簇,Cu納米簇(Cu NCs)報(bào)道較少。Cu NCs由幾個(gè)至幾十個(gè)Cu原子所組成[2]，是一種可代替有機(jī)熒光團(tuán)的新型熒光探針[3],由于其獨(dú)特的尺寸依賴性,具有不同于原子或塊狀Cu的物質(zhì)的電子性質(zhì)和光學(xué)性質(zhì),且使用廣泛、原料廉價(jià)和自然含量豐富等優(yōu)點(diǎn)[4]，具有良好的應(yīng)用前景。但是Cu NCs在水溶液中的粒徑大小及穩(wěn)定性都很難控制,目前對(duì)于Cu NCs的研究仍處于發(fā)展階段[5]，因此，研究一種穩(wěn)定且粒徑小的Cu NCs是科研工作的一個(gè)熱點(diǎn)。

林可霉素(Lincomycin,Lin)為林可胺類抗生素，臨床上主要用于治療革蘭氏陽(yáng)性菌，特別是耐青霉素的革蘭氏陽(yáng)性菌所引起的各種感染，也可以直接乳房注射治療奶牛的乳房炎;6]，因此在牛奶和豬肉里可能有該抗生素殘留，影響消費(fèi)者的身體健康,所以研究一種快速、簡(jiǎn)單測(cè)定林可霉素的方法是非常必要的?，F(xiàn)有測(cè)定林可霉素的方法有質(zhì)譜法[7]、高效液相色譜法[8]、化學(xué)發(fā)光法[9]、酶聯(lián)免疫吸附法[10]、背景熒光免疫層析法[11]等。這些方法有的儀器價(jià)格昂貴，有的樣品前處理復(fù)雜，不適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。本方法采取化學(xué)還原的方法以CuCl2為原料，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)為模板，2-巰基苯并噻唑(MBT)為穩(wěn)定劑，葡萄糖為還原劑，于常溫下合成水溶性好且穩(wěn)定、發(fā)射黃綠色熒光的Cu NCs。林可霉素對(duì)Cu NCs的熒光具有猝滅作用，據(jù)此建立了檢測(cè)林可霉素含量的熒光分析新方法。該方法具有操作簡(jiǎn)便、檢出限低、準(zhǔn)確度高，可用于測(cè)定豬肉、牛奶等動(dòng)物源性食品中林可霉素殘留量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC熒光分光光度計(jì)(島津(蘇州)公司);UV-2550紫外分光光度計(jì)(島津(蘇州)公司);Tecnai G2 F205-TWIN透射電子顯微鏡(美國(guó)，F(xiàn)EI公司)。

林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品(江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司,CAS No.:859-18-7，純度88%)溶液：準(zhǔn)確稱取0.0044 g林可霉素，溶解后將其定容到100 mL的容量瓶中，得到1.0×10-4mol/L儲(chǔ)備液，避光保存。林可霉素注射液(天方藥業(yè)有限公司、山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司2 mL:0.6 g)溶液：精密吸取鹽酸林可霉素注射液1 mL，用二次蒸餾水稀釋到10 mL比色管中，制得含林可霉素6.77×10-5mol/L的溶液。2-巰基苯并噻唑(MBT，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)溶液：準(zhǔn)確稱取0.0417 g MBT，加1.0 mol/L NaOH溶液1 mL溶解后，將其定容到25 mL的容量瓶中，得1.0×10-2mol/L的儲(chǔ)備液，在4 ℃的冰箱里放置12 h后使用。聚乙烯吡咯烷酮(K30)(PVP，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)溶液；準(zhǔn)確稱取1.25 g PVP，溶解后定容到25 mL的容量瓶中，得1.0×10-3mol/L的儲(chǔ)備液。CuCl2(天津市化學(xué)試劑三廠)。實(shí)驗(yàn)所用藥品均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Cu NCs的制備于25 mL比色管中，依次加入0.5 mL 1.0×10-2mol/L CuCl2溶液，1.5 mL1.0×10-3mol/L PVP溶液，1.5 mL 1.0×10-2mol/L MBT溶液，1.5 mL 1.0×10-4mol/L葡萄糖溶液，用二次蒸餾水定容到25 mL，混合均勻，靜置10 min后，于4 ℃的冰箱中保存(48 h內(nèi)使用)。

1.2.2 林可霉素的檢測(cè)取兩支25 mL比色管，各加入0.5 mL Cu NCs溶液，2 mL pH=5.0的HAc緩沖溶液，其中一支加入0.5 mL 1.0×10-4mol/L林可霉素溶液，用二次蒸餾水定容到25 mL。室溫下放置40 min后，用1 cm比色皿，設(shè)定狹縫寬度為10 nm，在激發(fā)波長(zhǎng)355 nm，發(fā)射波長(zhǎng)580 nm下分別測(cè)量熒光強(qiáng)度F0、F，計(jì)算ΔF(ΔF=F0-F)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu NCs的合成條件優(yōu)化

考察了合成Cu NCs各種原料的用量。按“1.2.1”，固定其它條件不變，分別改變1.0×10-2mol/L CuCl2溶液，1.0×10-2mol/L MBT溶液，1.0×10-3mol/L PVP溶液和1.0×10-4mol/L葡萄糖溶液的用量，定容到25 mL制備Cu NCs，在激發(fā)波長(zhǎng)335 nm下測(cè)量熒光光譜。結(jié)果表明:葡萄糖用量為1.5 mL，PVP用量為2.5 mL，MBT用量為2.5 mL，CuCl2用量為0.7 mL時(shí)Cu NCs的熒光最強(qiáng)。所以以上用量為制備Cu NCs的最佳條件。

2.2 Cu NCs穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和熒光量子產(chǎn)率

取0.5 mL Cu NCs溶液，固定其他條件不變，只改變溫度、放置時(shí)間，光照、pH、氧化還原劑，測(cè)定Cu NCs的穩(wěn)定性。結(jié)果表明:pH為5～7、溫度為30 ℃時(shí)熒光最強(qiáng)，Cu NCs放置時(shí)間為10 min以后2 h內(nèi)基本穩(wěn)定，光照影響較小，加入0.25%的H2O2溶液作為氧化劑，以30 mg/L的Na2SO3溶液作為還原劑，分別測(cè)定Cu NCs 熒光強(qiáng)度的變化。結(jié)果表明加入H2O2和Na2SO3，體系熒光強(qiáng)度變化較小。

測(cè)量所合成的Cu NCs在335 nm處的吸光度和熒光發(fā)射光譜。以上所測(cè)得的所有熒光發(fā)射光譜用Origin軟件求得峰面積。Cu NCs的量子產(chǎn)率根據(jù)如下公式計(jì)算[12]:ΦX=ΦR×(IX/IR)×(AR/AX)。式中，I代表熒光發(fā)射曲線的峰面積，A指吸光光度值，Φ指熒光量子產(chǎn)率值，下標(biāo)X代表待測(cè)物，R代表標(biāo)準(zhǔn)物選取硫酸奎寧作為基準(zhǔn)物質(zhì)，已知其在激發(fā)波長(zhǎng)為335 nm處的熒光量子產(chǎn)率為0.54,計(jì)算得Cu NCs 的熒光量子產(chǎn)率為0.47。

2.3 Cu NCs的表征

為了表征原料和產(chǎn)物的關(guān)系，分別配制1.0×10-3mol/L CuCl2溶液，1.0×10-2mol/L MBT溶液，1.0×10-3mol/L PVP(K30)，1.0×10-4mol/L葡萄糖溶液。取0.5 mL的Cu NCs溶液定容到25 mL，用1 cm比色皿，測(cè)定250～450 nm處的紫外-可見(jiàn)光譜，結(jié)果如圖1。上述溶液在335 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定熒光光譜，結(jié)果如圖2。圖1中曲線1、2、3說(shuō)明CuCl2、PVP、葡萄糖在350 nm處沒(méi)有吸收，曲線4說(shuō)明MBT只在280 nm處有吸收，曲線5說(shuō)明Cu NCs在368 nm處有吸收，說(shuō)明其它原料不影響Cu NCs對(duì)紫外光的吸收;圖2曲線1表明Cu NCs在335 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，于580 nm左右出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光;其它曲線說(shuō)明CuCl2、PVP、葡萄糖、MBT溶液在580 nm處沒(méi)有熒光。說(shuō)明生成了Cu NCs，并且原料對(duì)Cu NCs的熒光沒(méi)有干擾。

圖1 Cu NCs體系的紫外光譜圖Fig.1 The UV spectra of Cu NCs system

圖2 Cu NCs及各原料的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of Cu NCs and each raw material

為了表征是否生成了Cu NCs，把生成的Cu NCs溶液在普通微柵支持膜上附著三次，在紅外燈下照射干燥，然后在Tecnai G2F205-TWIN透射電子顯微鏡(TEM)下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖3。用X射線光電子能譜(XPS)測(cè)定Cu NCs體系各元素的化學(xué)狀態(tài)，Cu的化學(xué)狀態(tài)如圖4。由圖3可知，合成的Cu NCs的粒徑分布均勻并基本呈球形，其平均粒徑為5～7 nm左右。采用XPS測(cè)定樣品中Cu的氧化狀態(tài)，從全圖來(lái)看，有C、O、N、S、Cu元素，從譜圖4中看到，在932.3 eV和952.0 eV處觀察到兩個(gè)強(qiáng)烈的峰，這兩個(gè)峰代表了Cu(0) 的2p3/2和2p1/2特征，證明合成了Cu NCs。

圖3 Cu NCs透射電鏡(TEM)圖Fig.3 TEM image of Cu NCs

圖4 Cu NCs 中Cu 2p的X射線光電子能譜(XPS)圖Fig.4 XPS spectrum of Cu 2p for Cu NCs

2.4 測(cè)定林可霉素體系的熒光光譜圖

于25 mL比色管中，各加入pH=5.0的乙HAc緩沖溶液2 mL，再分別加入0.5 mL Cu NCs，0.5 mL 1.0×10-4mol/L的林可霉素，同濃度的Cu NCs和林可霉素的混合物，用二次蒸餾水定容到25 mL，在激發(fā)波長(zhǎng)335 nm處測(cè)得各自熒光強(qiáng)度，得到圖5。圖5表明:曲線1為Cu NCs 在580 nm處有較強(qiáng)的熒光，曲線3為林可霉素在580 nm處沒(méi)有熒光，曲線2說(shuō)明林可霉素加入Cu NCs溶液使其熒光猝滅，可以選擇性測(cè)定林可霉素。實(shí)驗(yàn)測(cè)得林可霉素可以猝滅450 nm處MBT的熒光，推測(cè)林可霉素中季氨氮容易與巰基反應(yīng)，結(jié)果MBT對(duì)Cu NCs的保護(hù)作用減弱，Cu NCs加大團(tuán)簇趨勢(shì)，熒光猝滅。

圖5 林可霉素對(duì)Cu NCs作用的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra revealing the effects of lincomycin on Cu NCs

2.5 pH、反應(yīng)時(shí)間和溫度對(duì)體系的影響

用NaOH溶液和HCl調(diào)節(jié)測(cè)定體系的pH，研究pH對(duì)體系的影響。ΔF隨pH的升高先增大后減小，當(dāng)反應(yīng)溶液pH=5.0,溶液的ΔF最大，即林可霉素對(duì)Cu NCs的熒光猝滅效果最好。所以本實(shí)驗(yàn)選用pH=5.0的HAc緩沖體系2 mL為反應(yīng)介質(zhì)。

體系在5 min后反應(yīng)完全，并且在40 min時(shí)ΔF最大，以后基本不變，為方便測(cè)定故實(shí)驗(yàn)選擇在40 min后測(cè)定。設(shè)定20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃不同的溫度進(jìn)行反應(yīng)。結(jié)果表明:當(dāng)反應(yīng)溫度為30 ℃時(shí)，溶液的ΔF最大，即林可霉素對(duì)Cu NCs的熒光猝滅效果最好。

2.6 工作曲線和檢出限

按“1.2.2”的實(shí)驗(yàn)方法，取兩支25 mL的比色管，準(zhǔn)確加入0.5 mL的Cu NCs溶液，然后分別加入1.0×10-4mol/L、1.0×10-5mol/L、1.0×10-6mol/L、1.0×10-7mol/L林可霉素溶液，以不加林可霉素溶液作為空白，在激發(fā)波長(zhǎng)335 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，測(cè)定結(jié)果如圖6。結(jié)果表明:林可霉素在濃度為4.0×10-8～8.0×10-7mol/L和8.0×10-7～2.0×10-5mol/L范圍呈良好的線性關(guān)系，其線性關(guān)系式分別為：ΔF=210.8c+19.29(c，μmol/L)；ΔF=28.42c+251.1(c，mol/L)，相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.9956 和0.9922。做11次空白試驗(yàn)，求得其標(biāo)準(zhǔn)偏差(δb)，利用3δb/K公式求得檢出限為1.01×10-8mol/L。

圖6 不同濃度林可霉素下Cu NCs的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of Cu NCs with different concentrations of lincomycin

2.7 共存物質(zhì)干擾測(cè)定

2.8 樣品的檢測(cè)和加標(biāo)回收率

選擇兩個(gè)不同廠家的林可霉素注射液，取1 mL稀釋后的林可霉素注射液分別為樣品1和樣品2。吸取伊利牛奶樣品18 mL置于40 mL離心管中，加入1 mL 20%HAc溶液和1 mL二次蒸餾水。旋渦振蕩5 min，于 4 ℃冷藏保存20 min。以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取上清液。沉淀再加5 mL二次蒸餾水，旋渦振蕩5 min，離心10 min，合并上清液[13]，得樣品3和樣品4。4個(gè)樣品按“1.2.2”的方法進(jìn)行測(cè)定，平行測(cè)定3次，求得標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，可知方法精密度較好;分別加入被測(cè)樣的5、10、15 mL標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定回收率，由回收實(shí)驗(yàn)可知，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差較小。

表1 樣品的測(cè)定結(jié)果及回收率(n=3)Table 1 Determination results of sample and recoveries(n=3)

2.9 本法與液相色譜法比較

為了驗(yàn)證Cu NCs熒光猝滅法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法(液相色譜法)的差異，取牛奶樣品1 mL，分別加入一定量的林可霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用Cu NCs熒光猝滅法和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果如表2。采用 SPSS 17.0 軟件，對(duì)Cu NCs熒光猝滅法測(cè)定值和國(guó)標(biāo)法測(cè)定值經(jīng)t檢驗(yàn)分析(P>0.05)，兩種方法沒(méi)有顯著性差異。

表2 本法和國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較(x+s，n=3，μmol/L)Table 2 Comparison of the determination results of this method and the national standard method

3 討論

與傳統(tǒng)測(cè)定林可霉素的方法相比，本方法在常溫下合成水溶性好且穩(wěn)定性好的Cu NCs，原料便宜，Cu NCs熒光量子產(chǎn)率較高，以此Cu NCs作為熒光探針檢測(cè)林可霉素，紫外燈下可視黃綠色變深，方法檢出限低，干擾較小，可用于制作光電傳感器。本研究可用于檢測(cè)林可霉素的殘留，結(jié)果與國(guó)標(biāo)法的檢測(cè)結(jié)果用t檢驗(yàn)分析，無(wú)明顯差異。本方法操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)林可霉素的現(xiàn)場(chǎng)快速定量檢測(cè)，為食品安全領(lǐng)域快速檢測(cè)林可霉素奠定了基礎(chǔ)。