趙曉亞*， 陳新艷， 王 晗， 葉 誠(chéng)， 曹 維， 鄭茜玥， 王 鵬

(武漢海關(guān)技術(shù)中心，湖北武漢 430050)

利尿劑是臨床常用藥物，廣泛應(yīng)用于利尿消腫、降壓和腦水腫等的治療。近年來，利尿劑也被用于家畜的養(yǎng)殖及疾病治療中，因而在許多動(dòng)物源性食品可能存在殘留。利尿劑進(jìn)入人體后，可直接或間接導(dǎo)致腎臟功能和組織學(xué)改變，通過細(xì)胞外容量的減少、入球和出球小動(dòng)脈張力的改變和球-管反饋等機(jī)制，導(dǎo)致腎血流量的減少和腎小球?yàn)V過率的下降。其還可引起急性間質(zhì)性腎炎、腎小管堵塞等腎臟損害，長(zhǎng)期攝入利尿劑可導(dǎo)致腎結(jié)石、尿沉渣異常和低鉀性腎病等慢性改變，具有較強(qiáng)的腎毒性作用[1 - 8]。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的利尿劑的檢測(cè)方法主要是高效液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，檢測(cè)對(duì)象集中在人體及動(dòng)物的尿液[9 - 12]和血液[13,14]、飼料[15]、保健品或者功能食品[16 - 18]等。針對(duì)動(dòng)物源性食品中利尿劑的檢測(cè)方法報(bào)道非常少。因此，本文建立了豬肉中氫氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺內(nèi)酯、坎利酮10種利尿劑殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，該方法具有快速、靈敏、定性定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

QTRAP 5500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)，AB SCIEX)；GM200刀式研磨儀(德國(guó)，Retsch)；ML303/02電子天平(美國(guó)，METTLER TOLEDO)；2-16PK型低溫離心機(jī)(德國(guó)，Sigma)；MS2型漩渦混合儀(德國(guó)，IKA)，TurboVap LV型氮吹儀(瑞典，Biotage)；Milli-Q超純水器(美國(guó)，Millipore)。

10種利尿劑標(biāo)準(zhǔn)品：氫氯噻嗪(Hydrochlorothiazide,Dr)、氯噻嗪(Chlorothiazide,Dr)、氨苯喋啶(Triamterene,TMstandard)、丙磺舒(Probenecid,CATO)、氯噻酮(Chlorthalidone,TMstandard)、乙酰唑胺(Acetazolamide,LGC)、呋塞米(Furosemide,TMstandard)、精磺胺(4-Amino-6-chlorobenzene-1,3-disulfonamide,TMstandard)、螺內(nèi)酯(Spironolactone,BePure)、坎利酮(Canrenone,TMstandard)，純度≥98%。分別稱取10種利尿劑標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解(氨苯喋啶先用少量冰HAc溶解)，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于-18 ℃保存。在實(shí)驗(yàn)過程中精確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇溶液逐級(jí)稀釋至所需分析物濃度。甲醇、乙腈、甲酸(色譜純，德國(guó)Merck)；KH2PO4、無水MgSO4(分析純)；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、石墨化碳黑(GCB)用于實(shí)驗(yàn)。

豬肉樣品購(gòu)于武漢集貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 樣品前處理

稱取2 g試樣，置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈和2 g KH2PO4，振蕩提取30 min后，于0 ℃以9 000 r/min離心5 min，取出上清液，再向殘?jiān)屑尤?0 mL乙腈重復(fù)提取1次，離心后合并上清液，置于50 mL離心管中，待凈化。

在待凈化上清液中加入150 mg無水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18、10 mg GCB，渦旋混合30 s后，于0 ℃以9 000 r/min離心5 min，取全部上清液于45 ℃下用氮?dú)獯抵两?，?zhǔn)確加入2.0 mL初始流動(dòng)相溶液溶解殘?jiān)?，溶液過0.22 μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相為水(A)和0.1%甲酸甲醇溶液(B)。梯度洗脫程序：0～1.0 min，B保持10%；1.0～3.5 min，B從10%變?yōu)?5%；3.5～11.0 min，B從65%變?yōu)?7%；11.0～11.5 min，B從97%變?yōu)?0%；11.5～15.0 min，B保持10%。流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；柱溫30 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式檢測(cè)；氣簾氣壓力(CUR，kPa)：241(氮?dú)?；霧化氣壓力(GS1，kPa)：414(氮?dú)?；輔助氣壓力(GS2，kPa)：355(氮?dú)?；正離子掃描電噴霧電壓(IS)：5 000 V；負(fù)離子掃描電噴霧電壓(IS)：-4 500 V。碰撞能量(CE)、去簇電壓(DP)等。主要質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 10種利尿劑的主要參考質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 10 kinds of diuretics for LC-MS/MS

2 結(jié)果與討論

2.1 溶液穩(wěn)定性

本工作對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。10種利尿劑的0.5 mg/mL儲(chǔ)備溶液在-18 ℃保存條件下，在1、10、20、30、45、60、75、90 d時(shí)，分別取10種利尿劑的儲(chǔ)備溶液用甲醇混合稀釋成10.0 ng/mL，考察了儲(chǔ)備溶液的穩(wěn)定性。1.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液在4 ℃保存條件下，在1、10、20、30、45 d 時(shí)用甲醇混合稀釋成10.0 ng/mL，考察了混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在90 d內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液變化為99.4%～99.7%，在45 d內(nèi)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液變化為99.6%～99.1%。

2.2 提取條件的選擇

10種利尿劑均為具有一定極性的化合物，適合采用極性溶劑進(jìn)行提取，故用乙酸乙酯、乙腈、甲醇作為提取溶劑進(jìn)行了提取效果對(duì)比。在空白基質(zhì)中添加20 μg/kg的利尿劑標(biāo)準(zhǔn)品作為測(cè)試樣品，結(jié)果表明乙腈的提取率較高且干擾少。對(duì)比了在提取過程中加入無水N2SO4、KH2PO4、無水MgSO4、NaCl、檸檬酸鈉對(duì)提取效率的影響，結(jié)果表明加入KH2PO4時(shí)的回收率比較高。

2.3 凈化條件的選擇

常用的QuEChERS凈化材料包括PSA、C18和GCB，通常還會(huì)加入無水MgSO4去除水分。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)對(duì)各凈化劑的用量進(jìn)行了優(yōu)化，正交試驗(yàn)條件如表2所示。不同凈化劑比例條件下的凈化結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，第2組凈化劑比例條件下的凈化效果較好。因此，在后續(xù)凈化中采用150 mg無水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18、10 mg GCB這一添加比例。

表2 正交試驗(yàn)表Table 2 Parameters for orthogonal test

表3 不同吸附劑比例對(duì)凈化效果的影響Table 3 Purification effect of different amount of adsorbents

2.4 線性關(guān)系、檢出限和重現(xiàn)性

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，方法學(xué)考察表明，豬肉中氫氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮的檢出限為2.0 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg；乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺內(nèi)酯、坎利酮的檢出限為5.0 μg/kg，定量限為10.0 μg/kg。圖1為空白豬肉基質(zhì)中添加10種利尿劑定量限濃度的提取離子色譜圖。氫氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮的線性范圍為5～100 μg/L，乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺內(nèi)酯、坎利酮的線性范圍為10～200 μg/L，線性關(guān)系如表4中所示。

表4 豬肉中10種利尿劑的線性關(guān)系Table 4 Linear relationship of 10 kinds of diuretics in pork

圖1 空白豬肉基質(zhì)及其添加10種利尿劑的提取離子色譜圖。(A)正離子模式空白樣品；(B)正離子模式加標(biāo)樣品;(C)負(fù)離子模式空白樣品；(D)負(fù)離子模式加標(biāo)樣品。Fig.1 Extracted ion chromatograms of blank pork and spiking sample.(A)Blank sample of positive ion mode;(B)Spiked sample of positive ion mode(Triamterene：5.64 min,probenecid:9.33 min,spironolactone:9.42 min,canrenone:9.86 min);(C)Blank sample of negative ion mode;(D)Spiked sample of negative ion mode(Hydrochlorothiazide:4.86 min,chlorothiazide:4.71 min,chlorthalidone:6.23 min,acetazolamide:5.01 min,furosemide:7.02 min,4-amino-6-chlorobenzene-1,3-disulfonamide:4.13 min).

2.5 方法的回收率和精密度

將本方法應(yīng)用于市售的豬肉樣品中10種利尿劑的檢測(cè)，在實(shí)際樣品中均未檢出。因此，采用經(jīng)測(cè)定不含目標(biāo)物的豬肉樣品進(jìn)行加入回收率和精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。10種利尿劑在空白豬肉基質(zhì)中不同濃度水平的添加回收率在83.5%～96.6%之間，精密度(RSD)小于10.1%。

表5 豬肉樣品中10種利尿劑的加標(biāo)回收率(n=7)Table 5 Recoveries of 10 kinds of diuretics in pork samples(n=7)

(續(xù)表5)

3 結(jié)論

本方法利用乙腈進(jìn)行提取，分散固相萃取凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)豬肉樣品中10種利尿劑殘留進(jìn)行定性與定量檢測(cè)。該方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，可用于日常豬肉樣品中氫氯噻嗪、氯噻嗪、氨苯喋啶、丙磺舒、氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、精磺胺、螺內(nèi)酯、坎利酮?dú)埩舻亩ㄐ约岸繖z測(cè)。