吳 斌，王海華*，曾慶祥，徐先棟，馬本賀

(1.江西省水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 南昌 330039；2.贛州市水產(chǎn)科學(xué)研究所，江西 贛州 341000)

鱸形目(Perciformes)刺鰍科(Mastacembelidae)魚類分布于非洲、東亞及南亞地區(qū)，其中刺鰍屬(Mastacembelus)總共62個(gè)有效種[1-2]。分布于國(guó)內(nèi)的刺鰍主要有5種，包括刺鰍屬的4種，即大刺鰍(Mastacembelusarmatus)、腹紋刺鰍(Mastacembelusstrigiventus)、三葉刺鰍(Mastacembelustriolobus)、云斑刺鰍(Mastacembelusoatesii)，以及中華刺鰍屬的中華刺鰍(Sinobdellasinensis)。其中，腹紋刺鰍、三葉刺鰍為2011年記述的2個(gè)新種，云斑刺鰍為新紀(jì)錄種，三者在國(guó)內(nèi)均只分布于云南省的部分地區(qū)。而大刺鰍主要分布于長(zhǎng)江、珠江等流域，江西贛州定南縣和信豐縣等地具有一定的資源量。中華刺鰍則主要分布于國(guó)內(nèi)東部地區(qū)，鄱陽(yáng)湖地區(qū)也具有較廣泛的分布[3-5]。魚類親緣關(guān)系的傳統(tǒng)研究是基于形態(tài)分類學(xué)，刺鰍屬魚類的相關(guān)研究也局限于此。近年來，隨著DNA序列信息的不斷豐富，可以從分子水平上進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生的研究。由細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ亞基(COI)基因組成的DNA條形碼因其具有標(biāo)準(zhǔn)的分類學(xué)研究、生物多樣性研究、分子發(fā)育系統(tǒng)學(xué)研究等特點(diǎn)，目前已經(jīng)被廣泛運(yùn)用于研究國(guó)內(nèi)外魚類分子系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳和物種分化等方面[6-8]。本文通過研究線粒體的COI基因序列片段，初步分析了中華刺鰍與部分刺鰍屬魚類之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，旨在了解刺鰍屬魚類之間的親緣關(guān)系，并為刺鰍屬魚類資源保護(hù)、系統(tǒng)進(jìn)化和雜交育種提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

刺鰍屬在FishBase數(shù)據(jù)庫(kù)中共有62個(gè)有效種，用拉丁名在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索下載COI基因序列，得到27個(gè)有效種的COI基因序列，將其用于進(jìn)行生物信息學(xué)分析的同時(shí)，為進(jìn)一步明確中華刺鰍和刺鰍屬的魚類的關(guān)系，下載中華刺鰍的COI基因序列，以鯉作為外群構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹，用于本研究，共計(jì)29條序列，具體見表1。

表1 試驗(yàn)所選用魚類的COI基因信息

1.2 數(shù)據(jù)分析

通過FasParser 2.10.0獲得COI基因轉(zhuǎn)錄本最長(zhǎng)(Open reading frame,ORF)開放閱讀框序列，隨后MEGA-X進(jìn)行上述序列對(duì)齊。采用DAMBE 6.4軟件對(duì)COI基因最長(zhǎng)ORF序列進(jìn)行飽和度檢測(cè)，分別采用MEGA-X軟件中的鄰接法(Neighbour-Joining，NJ)、最大簡(jiǎn)約法(Maximum parsimony，MP)構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 COI基因堿基組成編碼氨基酸及密碼子使用分布概率

首先，計(jì)算刺鰍屬魚類27條序列的堿基組成，平均長(zhǎng)度為670.5±24.8(602～688) bp。堿基組成：A總頻率4696,占比25.9%；C總頻率5272,占比29.1%；G總頻率3119，占比17.2%；T總頻率5013，占比27.7%；N總頻率3，占比0%。A+T含量(53.6%)明顯高于G+C含量(46.4%)。中華刺鰍COI基因中，A+T含量(57.8%)也明顯高于G+C含量(42.2%)。最后，筆者還將27種刺鰍屬魚類COI基因部分序列編碼20種氨基酸及密碼子使用分布概率進(jìn)行了分析，具體結(jié)果見表2。

表2 刺鰍屬魚類COI基因部分序列編碼氨基酸及密碼子使用情況

2.2 種間遺傳距離

應(yīng)用MEGA-X中Kimura雙參數(shù)法計(jì)算刺鰍屬魚類、中華刺鰍以及鯉等29條COI基因序列的種間遺傳距離，發(fā)現(xiàn)中華刺鰍(組別，1)與大多數(shù)刺鰍屬魚類均保持中等遺傳距離(0.162～0.217)，但與非洲坦噶尼喀湖特有的Mastacembelusalbomaculatus(組別，11)的遺傳距離較遠(yuǎn)，達(dá)到0.268，此外，中華刺鰍與鯉(組別，12)的遺傳距離為0.299。進(jìn)一步分析Mastacembelusalbomaculatus與其他刺鰍屬魚類的遺傳距離，發(fā)現(xiàn)均保持較遠(yuǎn)的遺傳距離(0.238～0.285)，Mastacembelusalbomaculatus與鯉的遺傳距離為0.309。隨后，還分析了大刺鰍(組別，2)與其他刺鰍屬魚類的遺傳距離，發(fā)現(xiàn)與大多數(shù)刺鰍屬魚類均保持較近遺傳距離(0.113～0.164)，但大刺鰍與Mastacembelusalbomaculatus的遺傳距離為0.275，與中華刺鰍的遺傳距離為0.168，與鯉的遺傳距離為0.285，具體結(jié)果見表3。最后，筆者分別計(jì)算了27種和26種(剔除Mastacembelusalbomaculatus)刺鰍屬魚類的平均遺傳距離，分別為0.134和0.123。

表3 29種魚類的種間遺傳距離

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

采用DAMBE6.4軟件對(duì)COI基因最長(zhǎng)ORF序列進(jìn)行飽和度檢測(cè)，均滿足條件雙尾檢測(cè)P<0.01，ISS

圖1 基于COI部分序列片段NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹圖2 基于COI部分序列片段MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹

3 討論

刺鰍屬魚類和中華刺鰍的關(guān)系一直存在爭(zhēng)論。1984年Travers將中華刺鰍歸入鰻鰍科(Chaudhuriidae)。但Kottelat[9-10]和Britz[11]等一致認(rèn)為中華刺鰍屬于刺鰍科。Kottelat等[9-10]還通過形態(tài)學(xué)特征分析，為中華刺鰍獨(dú)立建立了中華刺鰍屬(Sinobdella)。在線粒體DNA序列中，D-Loop區(qū)由于進(jìn)化速度相對(duì)較快，通常用于群體遺傳學(xué)及近緣種間關(guān)系研究，12 S rRNA、16 S rRNA、COI基因序列等具有進(jìn)化速率適中、容易擴(kuò)增和排序、含有相對(duì)豐富的系統(tǒng)發(fā)育信息等優(yōu)點(diǎn)，通常用于種屬間至科級(jí)以下分類階元系統(tǒng)發(fā)育分析研究[12-14]。不過，線粒體COI基因動(dòng)物線粒體基因組有一個(gè)共性，即A、T、C、G等4種核苷酸在線粒體基因組中的分布存在差異性[15]。由于存在的選擇壓力和自然突變的差異，導(dǎo)致DNA分子上堿基的分布往往存在不均衡現(xiàn)象[16]，且密碼子使用偏好模式與編碼基因的GC含量有關(guān)[17]。因此，對(duì)該基因密碼子使用偏好模式進(jìn)行了研究，將有助于揭示這一生物遺傳學(xué)現(xiàn)象在魚類系統(tǒng)分類研究中的有效性。密碼子偏好性在生物界中廣泛存在，不同物種的基因密碼子使用也存在較大差異[18]。由分析結(jié)果可見，在27種刺鰍屬魚類COI基因中，A+T含量(53.6%)明顯高于G+C含量(46.4%)；在中華刺鰍COI基因中，A+T含量(57.8%)也明顯高于G+C含量(42.2%)，這與大部分魚類的COI基因序列研究的結(jié)果一致。通過對(duì)27種刺鰍屬魚類COI基因密碼子使用偏好分析也發(fā)現(xiàn)，密碼子3個(gè)位點(diǎn)的GC堿基含量亦存在分布不均衡現(xiàn)象，密碼子使用偏好性是物種進(jìn)化過程中基因突變和自然選擇的結(jié)果，對(duì)物種起源和進(jìn)化研究具有一定的意義[8]。

筆者通過系統(tǒng)收集目前能夠獲取的全部刺鰍屬魚類的COI基因序列，與中華刺鰍比較發(fā)現(xiàn)，中華刺鰍與刺鰍屬魚類的遺傳距離確實(shí)相對(duì)較近，中華刺鰍與大多數(shù)刺鰍屬魚類均保持中等遺傳距離(0.162～0.217)，略高于刺鰍屬魚類的平均遺傳距離(0.123～0.134)，因此本研究結(jié)果支持中華刺鰍屬于刺鰍科，同時(shí)建議重新整理刺鰍屬。值得特別注意的是，非洲坦噶尼喀湖特有的Mastacembelusalbomaculatus與其他刺鰍屬魚類均保持較遠(yuǎn)的遺傳距離(0.238～0.285)，與中華刺鰍的遺傳距離也達(dá)到0.268。由NJ和MP法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹提示，非洲坦噶尼喀湖特有的Mastacembelusalbomaculatus是相對(duì)較古老的類群，刺鰍屬魚類可能起源于非洲，但由于本研究選取的物種類別及數(shù)量有限，另外使用一個(gè)線粒體基因往往有一定局限性，不能較好地解決魚類的系統(tǒng)發(fā)生問題，需要進(jìn)一步更加全面的分子生物學(xué)分析，收集更多種類的刺鰍屬魚類標(biāo)本，并進(jìn)行線粒體基因組測(cè)序，同時(shí)對(duì)關(guān)鍵物種進(jìn)行全基因組測(cè)序。大刺鰍體型相對(duì)較大，作為江西贛州、福建龍巖等地的特色經(jīng)濟(jì)魚類之一，其繁殖學(xué)的相關(guān)研究開展也較早，并已取得了人工繁殖的突破[19]，但中華刺鰍個(gè)體小、經(jīng)濟(jì)價(jià)值低。目前，其人工繁殖研究尚未見報(bào)道，但大刺鰍對(duì)養(yǎng)殖水體溫度要求相對(duì)較高，而中華刺鰍對(duì)低溫耐受能力相對(duì)較強(qiáng)，大刺鰍肌肉中的蛋白質(zhì)含量高于草魚和鯽魚，與青魚、泥鰍、鰻鱺、黃鱔等魚類均值相近，而中華刺鰍的肌肉蛋白質(zhì)含量高于大刺鰍[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，大刺鰍與大多數(shù)刺鰍屬魚類均保持較近遺傳距離(0.113～0.164)，但大刺鰍與Mastacembelusalbomaculatus的遺傳距離為0.275，與中華刺鰍的遺傳距離則只有0.168，因此，通過大刺鰍和中華刺鰍種間雜交，培育耐低溫且營(yíng)養(yǎng)高的新品種具有較大可行性。