鄒亞男，劉慶國(guó)，王松濤，趙 南，陳 勇，應(yīng)漢杰

(1.南京高新工大生物技術(shù)研究院有限公司,江蘇 南京 210061；2.瀘州品創(chuàng)科技有限公司,四川 瀘州 646099；3.南京工業(yè)大學(xué),江蘇 南京 211816)

近年來(lái)的研究證實(shí)了蛹蟲(chóng)草的活性物質(zhì)明顯高于冬蟲(chóng)夏草，可以作為冬蟲(chóng)夏草的替代品[1-2]?，F(xiàn)代科學(xué)論證蛹蟲(chóng)草不僅具有特殊的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且有明顯的藥用價(jià)值,其中尤以蟲(chóng)草素活性物質(zhì)的藥用價(jià)值最為顯著[3]。

目前，蟲(chóng)草素合成方法主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法2種。化學(xué)合成工藝復(fù)雜，產(chǎn)物回收率低，生產(chǎn)成本高；而生物發(fā)酵法是通過(guò)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵獲得，方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，易于工業(yè)化生產(chǎn)。不同研究者通過(guò)培養(yǎng)基配方優(yōu)化等以獲得高產(chǎn)蟲(chóng)草素的培養(yǎng)條件或蛹蟲(chóng)草菌株[4-6]。文庭池等[7]考察了蛹蟲(chóng)草菌株在通過(guò)光照振蕩、光照靜置、黑暗振蕩、黑暗靜置4種培養(yǎng)方式和添加前體物質(zhì)，發(fā)酵60 d后，發(fā)酵液內(nèi)蟲(chóng)草素和腺嘌呤含量變化，結(jié)果表明:CM3菌株在靜止培養(yǎng)及添加前體時(shí)蟲(chóng)草素的含量達(dá)2.54 g/L，腺嘌呤利用率達(dá)99.79%。荊留萍等[8]研究了不同前體物及營(yíng)養(yǎng)物對(duì)蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵中蟲(chóng)草素和蟲(chóng)草多糖含量的影響，結(jié)果顯示：腺苷、核糖、谷氨酰胺、甘氨酸均能明顯提高蟲(chóng)草素及蟲(chóng)草多糖的含量，其最適添加量分別為4、2～3，0.5～1.0、0.5 g/L。Shih等[9]以蛹蟲(chóng)草CCRC 32219為研究對(duì)象，考察了初始pH值、不同氮源、植物油和培養(yǎng)方式(搖瓶和靜態(tài)培養(yǎng))對(duì)蟲(chóng)草生物量和蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明：酵母提取物和玉米浸漬粉對(duì)蟲(chóng)草素合成有顯著提升作用，并且C/N比低也有利于蟲(chóng)草素的生產(chǎn)，植物油可以促進(jìn)蛹蟲(chóng)草的菌絲生長(zhǎng)，但對(duì)蟲(chóng)草素的產(chǎn)生影響不大，在最佳條件下，蟲(chóng)草素的最大產(chǎn)量為2.2 g/L。

筆者分析了不同碳源、前體物質(zhì)及微量元素等對(duì)蟲(chóng)草素發(fā)酵的影響，以期找到提高蟲(chóng)草素含量的發(fā)酵途徑，為蟲(chóng)草素研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株C.militarisCGMCC18581由C.militarisCICC14014經(jīng)物理化學(xué)復(fù)合誘變所得，保藏于南京高新工大生物技術(shù)研究院(CY1909)與中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。

1.1.2 試劑 葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉均采購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母蛋白胨、安琪酵母粉均采購(gòu)于市場(chǎng)；蛋白胨和酵母粉均為OXOID；腺嘌呤、腺苷、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸均采購(gòu)于上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 (1)固體培養(yǎng)基：土豆200 g煮沸過(guò)濾取汁，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，維生素B1 0.1 g，瓊脂15 g，定容至1 L，pH值自然。

(2)種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氫鉀0.2 g/L，磷酸氫二鉀0.2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，pH值5.8。

(3)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸二氫鉀0.2 g/L，磷酸氫二鉀0.2 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，吐溫-80 0.5 g/L，腺嘌呤4 g/L，pH值5.8。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-700立式全自動(dòng)滅菌鍋(由TOMY公司生產(chǎn))；ZQZY-CF震蕩培養(yǎng)箱(由上海知楚儀器有限公司生產(chǎn))；SW-CJ-1BU超凈工作臺(tái)(由蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn))；GENESYS 10S UV-Vis紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Agilent1260高效液相色譜儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)條件 (1)斜面菌株培養(yǎng)：將試驗(yàn)室保藏的蛹蟲(chóng)草菌株轉(zhuǎn)接至固體培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，獲得斜面菌種。

(2)種子培養(yǎng)：刮取培養(yǎng)好的斜面菌絲體接種至裝有200 mL種子培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，25 ℃，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)3～4 d。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：按10%接種量接種至裝有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的1 L三角搖瓶中，25 ℃下靜置發(fā)酵3～4周。

1.3.2 氮源優(yōu)化試驗(yàn) 采用不同品牌的蛋白胨、酵母粉進(jìn)行氮源優(yōu)化，按總氮量換算廉價(jià)氮源的添加量。具體配方見(jiàn)表1。

表1 不同氮源組合

1.3.3 單因素優(yōu)化 (1)單因素優(yōu)化試驗(yàn)。金屬離子為MnSO4、ZnSO4、CuSO4、CaSO4、FeSO4，濃度0.04 g/L；前體物質(zhì)為腺嘌呤、甘氨酸組合優(yōu)化試驗(yàn)。

(2)單因素爬坡試驗(yàn)。將最適蛋白胨質(zhì)量濃度調(diào)至30～50 g/L，最適酵母粉的質(zhì)量濃度調(diào)至3～20 g/L，微量元素質(zhì)量濃度調(diào)至0.02～0.14 g/L。

1.3.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn) 根據(jù)單因素爬坡試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)蛋白胨、酵母粉、硫酸亞鐵和前體物質(zhì)4個(gè)因素進(jìn)行Box-Benhnken試驗(yàn)，每個(gè)因素取3個(gè)水平，響應(yīng)值為蟲(chóng)草素產(chǎn)量，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) g/L

1.4 樣品檢測(cè)方法

1.4.1 蟲(chóng)草素檢測(cè) 取發(fā)酵液，10000 r/min離心10 min。上清液用容量瓶稀釋20倍后，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，得到待測(cè)樣品液。采用液相色譜法測(cè)定蟲(chóng)草素含量。

高效液相色譜條件：色譜柱Sepax HP-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，120?；檢測(cè)器：紫外線，波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇∶磷酸二氫鉀=25∶75；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。根據(jù)色譜峰保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，以外標(biāo)峰面積法進(jìn)行定量分析。

1.4.2 總氮檢測(cè)方法 采用全自動(dòng)凱氏定氮儀K9860檢測(cè)。

1.4.3 氨基酸檢測(cè) 參照白嵐[10]的研究文獻(xiàn)。

1.4.4 數(shù)據(jù)處理方法 采用Origin 8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖。Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)采用Design Expert軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源優(yōu)化

由圖1所示，編號(hào)1、3、9蟲(chóng)草素產(chǎn)量較高，其中編號(hào)1為OXOID的蛋白胨和酵母粉，成本較高，不采用；而編號(hào)3為信和酵母蛋白胨和編號(hào)9安琪酵母粉FM139分別是相對(duì)較佳的蛋白胨和酵母粉。

圖1 不同氮源組合對(duì)蟲(chóng)草素發(fā)酵的影響

從表3可知，在2種配方中，各氨基酸成分較為一致，且谷氨酸、天冬氨酸含量較高，該結(jié)果說(shuō)明2種配方相似組分保證了發(fā)酵效果的一致性。

表3 2種氮源組合下培養(yǎng)基中各氨基酸濃度 g/L

2.2 微量元素優(yōu)化

由圖2可以看出，Mn2+、Cu2+、和Ca2+對(duì)蟲(chóng)草素合成無(wú)明顯作用，甚至有一定的抑制作用；Zn2+對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量提高有一定的促進(jìn)影響，但效果不顯著。而添加少量Fe2+可以顯著提升蟲(chóng)草素的積累量。

圖2 不同金屬離子濃度對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

2.3 前體物質(zhì)優(yōu)化

由表4可知，在不加腺嘌呤條件下，蟲(chóng)草素產(chǎn)量隨著甘氨酸添加量的提高而提高，將甘氨酸濃度提高至12 g/L以上，對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量提高的貢獻(xiàn)度較低。在添加2 g/L的腺嘌呤后，蟲(chóng)草素產(chǎn)量提高顯著，甘氨酸濃度達(dá)8 g/L以上時(shí)，蟲(chóng)草素提高不明顯。另外，當(dāng)添加4 g/L的腺嘌呤條件下，甘氨酸從0提高到8 g/L，蟲(chóng)草素產(chǎn)量同樣提高不顯著。由于腺嘌呤價(jià)格遠(yuǎn)高于甘氨酸，結(jié)合發(fā)酵的效果，將腺嘌呤和甘氨酸添加量分別設(shè)定為2和8 g/L。

表4 不同腺嘌呤和甘氨酸組合對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

2.4 單因素爬坡試驗(yàn)

分別選擇單因素試驗(yàn)中發(fā)酵效果最好的廉價(jià)氮源(信和酵母蛋白胨、安琪酵母粉)和金屬離子(硫酸亞鐵)進(jìn)行爬坡試驗(yàn)(圖3)。當(dāng)信和酵母蛋白胨、安琪酵母粉、硫酸亞鐵濃度分別采用45 g/L、7 g/L、0.08 g/L時(shí)，蟲(chóng)草素的產(chǎn)量最高。

圖3 氮源和金屬離子對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

使用爬坡試驗(yàn)中獲得的各因子對(duì)應(yīng)的蟲(chóng)草素產(chǎn)量最高點(diǎn)為中心進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)并開(kāi)展試驗(yàn)，以蛋白胨、酵母粉、硫酸亞鐵、腺嘌呤/谷氨酸為自變量，以蟲(chóng)草素含量(Y)為響應(yīng)值，其方案與結(jié)果見(jiàn)表5。蟲(chóng)草素產(chǎn)量與自變量之間的回歸方程達(dá)極顯著水平(P<0.0001)，失擬項(xiàng)P=0.1770不顯著，表明失擬項(xiàng)影響效果較小，模擬的擬合程度較好[11]。由此表明該模型建立成功，并可以利用該模型對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。利用Desigin-Expert 8.0.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到其回歸方程：Y=-4.62+0.15A+0.54B+51.98C+0.60D-0.0013AB-0.25AC+0.0023AD-0.80BC-0.019BD-0.31CD-0.0013A2-0.022B2-249.22C2+0.14D2。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

利用軟件計(jì)算分析優(yōu)化得到4個(gè)因素的最佳質(zhì)量濃度為信和酵母蛋白胨52.25 g/L，利用軟件計(jì)算分析優(yōu)化得到4個(gè)因素的最佳質(zhì)量濃度分別為信和酵母蛋白胨52.25 g/L、安琪酵母粉8.43 g/L、硫酸亞鐵0.06 g/L、腺嘌呤3 g/L+甘氨酸12 g/L。在該方程模擬預(yù)測(cè)下的蟲(chóng)草素產(chǎn)量為6.21 g/L，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得蟲(chóng)草素產(chǎn)量6.35 g/L，與預(yù)測(cè)的產(chǎn)量相差2.25%。此外，該4個(gè)因素在發(fā)酵過(guò)程中的相互作用分析見(jiàn)圖4。

圖4 不同變量交互作用對(duì)蟲(chóng)草素產(chǎn)量的影響曲面圖

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)首先通過(guò)對(duì)不同氮源以高產(chǎn)蟲(chóng)草素為指標(biāo)進(jìn)行篩選，最終確定有效提高蟲(chóng)草素產(chǎn)量的為信和蛋白胨和安琪酵母粉。通過(guò)氨基酸組分分析，這2種氮源與價(jià)格昂貴的OXOID蛋白胨和酵母粉組分相似,且谷氨酸含量均較豐富。有研究表明，谷氨酰胺物能大幅提高蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵胞外蟲(chóng)草素的產(chǎn)量[12-14],而谷氨酸是谷氨酰胺的前體物質(zhì)，故對(duì)蟲(chóng)草素合成也有明顯促進(jìn)效果。

根據(jù)報(bào)道表明，腺苷是蟲(chóng)草菌素的直接前體，腺嘌呤又是腺苷的前體，故腺嘌呤對(duì)蟲(chóng)草素合成有明顯的正向調(diào)控作用[15-17]。甘氨酸與蟲(chóng)草素沒(méi)有直接的關(guān)聯(lián)，但可能影響蟲(chóng)草素前體物質(zhì)的合成。因?yàn)楸驹囼?yàn)在沒(méi)有添加腺嘌呤和其他前體物質(zhì)條件下，添加適量甘氨酸，蟲(chóng)草素產(chǎn)量有顯著提高。本試驗(yàn)篩選的最優(yōu)添加方式是2 g/L的腺嘌呤和8 g/L的甘氨酸組合。2種前體及營(yíng)養(yǎng)物能夠通過(guò)協(xié)同互補(bǔ)作用提高胞外蟲(chóng)草素的產(chǎn)量,這與文庭池等[18]研究的結(jié)果較為一致。

表6 回歸模型方差分析

另外，根據(jù)葉晶晶等對(duì)1株蛹蟲(chóng)草DY-1菌株進(jìn)行液體發(fā)酵配方優(yōu)化研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鐵離子對(duì)菌絲體生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，而蟲(chóng)草素產(chǎn)量與菌體生長(zhǎng)量呈正相關(guān)[19]。研究表明，硫酸亞鐵能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄水平，從而提高蟲(chóng)草素合成[20]}。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：FeSO4低濃度對(duì)蟲(chóng)草素積累量的影響較大，這與秦鵬等的研究結(jié)果相近[21]。

綜上所述，本研究為蛹蟲(chóng)草發(fā)酵產(chǎn)蟲(chóng)草素供了一組最優(yōu)的發(fā)酵配方，最佳配方為：信和酵母蛋白胨52.25 g/L、安琪酵母粉8.43 g/L、硫酸亞鐵0.06 g/L、腺嘌呤3 g/L+甘氨酸12 g/L。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得蟲(chóng)草素產(chǎn)量6.35 g/L，與預(yù)測(cè)的產(chǎn)量相差2.25%。該發(fā)酵優(yōu)化結(jié)果為后續(xù)放大發(fā)酵和應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。