陳坤，孫敬鋒，韓卓然，陳麗梅，胡秀彩，呂愛軍

(天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院,天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

腸道不僅是魚類消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，同時承擔(dān)重要的免疫防御功能。尤其是腸道黏膜系統(tǒng)，除了廣泛參與水、離子、營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和吸收，也是各種病原感染的主要入侵部位[1-3]。因此，腸道內(nèi)環(huán)境平衡對于維持宿主健康和生長至關(guān)重要[4]。

動物組織器官中存在多種具有不同生理功能的胞內(nèi)酶，這些胞內(nèi)酶在魚類消化道組織中廣泛分布，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。在烏鱧Ophiocephalusargus[5]和泥鰍Misgurnusanguillicaudatus[6]的消化道黏膜中廣泛存在酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、腺苷三磷酸酶(ATPase)、非特異性酯酶(NSE)、過氧化物酶(POD)、琥珀酸脫氫酶(SDH)等重要胞內(nèi)酶，這些酶在其食道、胃賁門、胃體、胃幽門、前腸、中腸、后腸等部位具有不同活性。對半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis[7]和錦鯉Cyprinuscarpiovar. koi[8]的研究發(fā)現(xiàn)，ACP、ALP、POD、NSE的分布遍及整個腸道組織，但其活性和分布特點在這兩種魚類中明顯不同。

黏液細胞普遍存在于水產(chǎn)動物的組織器官中。魚類中的黏液細胞主要分布在皮膚、鰓及消化道的上皮中。魚類腸道組織中普遍存在多種類型的黏液細胞，它們在促進消化、維持酸堿平衡與保護黏膜等方面發(fā)揮功能。在黃唇魚Bahabaflavolabiata[9]腸道組織中存在Ⅰ型和Ⅱ型黏液細胞；在半滑舌鰨[7]、錦鯉[8]、卵形鯧鲹Trachinotusovatus[10]腸道組織中，均觀察到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3種黏液細胞。由于魚的種類不同，其食性、生態(tài)位特性、營養(yǎng)需求具有差異，所以腸道組織中黏液細胞的類型、數(shù)量和分布特點在不同魚類中差異也較大。

建鯉Cyprinuscarpiovar. Jian具有生長速度快、抗病能力強、肉質(zhì)鮮美等特點，已成為鯉養(yǎng)殖的重要優(yōu)良品種。目前，對建鯉的生長特性[11]、營養(yǎng)需求[12]、養(yǎng)殖模式及技術(shù)[13]等方面已開展了廣泛研究，但對建鯉腸道組織中胞內(nèi)酶和黏液細胞的研究尚未見報道。本研究中，首次利用組織化學(xué)染色、光密度定量分析技術(shù)對建鯉腸道中胞內(nèi)酶和黏液細胞的分布與組織定位進行了研究，旨在為進一步深入研究建鯉腸道生理功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用建鯉購自天津市某養(yǎng)殖場，體質(zhì)量為(150 ± 30)g，體長為(18 ± 1)cm。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理 用MS-222將建鯉麻醉后解剖，參照Sun等[8]的方法將腸道分為前、中、后3個腸段，每個腸段分別用解剖刀平均分割為4部分。第一部分在冰凍切片機(Thermo Microm HM 525，MA，USA)上冷凍15 min后使用OCT(optimal cutting temperature compound)包埋，用于ACP組織化學(xué)染色；第二部分在質(zhì)量分數(shù)4%的甲醛鈣(4 ℃)中固定24 h，用于ALP和NSE染色；第三部分在體積分數(shù)25%的戊二醛中固定30 min后，使用OCT包埋，用于POD染色；第四部分在波恩氏液固定8 h，石蠟包埋機包埋，用阿爾辛藍過碘酸雪夫法(AB-PAS)染色。

所用陰性對照的組織切片進行孵育時，反應(yīng)液中不加入酶的底物。每個腸段組織選3張切片，每張切片隨機選取10個視野進行觀察、成像。

1.2.2 酶組織化學(xué) 參照Gomori[14]的方法進行ACP染色。切片于37 ℃孵育液中保持60 min，其中孵育液中含有10 mL醋酸緩沖液(0.05 mol/L，pH 5)、10 mg硝酸鉛、0.8 g蔗糖、1 mL質(zhì)量分數(shù)3%的β-甘油磷酸鈉。孵育完成后用蒸餾水清洗切片，用質(zhì)量分數(shù)1%的硫化銨復(fù)染1 min，再次洗滌，用乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后封片拍照。

采用NBT/BCIP法測定ALP活性。將組織切片在室溫下置于含質(zhì)量分數(shù)5%的硝基藍四唑(NBT)、質(zhì)量分數(shù)5%的5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(BCIP)、10 mL ALP緩沖液(100 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，100 mmol/L Tris-HCl，pH 9.5)的混合液中孵育20 min。然后用蒸餾水洗滌切片，乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后封片拍照觀察。

采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)法測定POD活性。將切片置于含10 mg DAB·4HCl、5 mL蒸餾水、5 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.0)的孵育液中孵育20 min。然后將100 μL的H2O2加入溶液中，在室溫下孵育30 min。用亞甲基藍染色，蒸餾水洗滌，乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后封片觀察。

采用萘酚AS鹽法測定NSE活性[15]。將切片置于含0.1 mL質(zhì)量分數(shù)1%的萘酚AS乙酸鹽、10 mL磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.0)、30 mg固紅TR鹽的溶液中孵育30 min，用質(zhì)量分數(shù)2%的甲基綠染色，蒸餾水洗滌，再用甘油明膠封片拍照。

1.2.3 AB-PAS染色 將組織切片用AB-pH 2.5-PAS染色試劑盒(Solarbio，北京)染色，乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后封片觀察。每個腸段組織選3張切片，每張切片取10個視野拍照用于數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 光密度定量 使用正置熒光顯微鏡(Leica DM 4000B)進行鏡檢拍照。利用Image圖像分析軟件，對酶組織化學(xué)染色陽性部位進行測定和光密度分析，計算平均光密度(ODM)，ODM值越高，代表酶活性越強。在400倍鏡下計數(shù)不同類型的黏液細胞數(shù)量，并計算其占相同部位數(shù)量的百分比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準差(mean ± S.D.)表示，采用SPSS 22軟件進行單因子方差分析(One-way ANOVA)，用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶組織化學(xué)染色

ACP組織化學(xué)陽性反應(yīng)呈棕褐色(圖1A～C)，廣泛分布于整個腸道組織；ACP活性位于前腸(圖1A)和后腸(圖1C)的腸道上皮細胞核上區(qū)，在中腸(圖1B)中，主要位于腸道上皮細胞的核上區(qū)和固有層。中腸ACP活性顯著高于前腸和后腸(P<0.05)，但前、后腸間無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

ALP的活性部位染色結(jié)果呈藍紫色，主要分布于整個腸道上皮的紋狀緣、肌層和肌層與黏膜下層的交界處(圖2A～C)；ALP活性位于中腸(圖2B)的柱狀上皮細胞，在前腸(圖2A)和后腸(圖2C)的黏膜固有層中檢測到少量ALP分布。中腸ALP活性最高(P<0.05)，前腸和后腸ALP活性較低，且兩者之間無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

POD的活性反應(yīng)部位呈茶褐色，根據(jù)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個腸道黏膜固有層和黏膜肌層中均檢測到POD活性(圖3A～C)。后腸POD活性最高(P<0.05)，中腸和前腸POD活性較低，且兩者之間無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

A—前腸；B—中腸；C—后腸；箭頭示POD活性部位。LP—固有層；MM—黏膜肌層。

NSE組織化學(xué)染色陽性反應(yīng)呈紫紅色，分布于整個腸道組織，尤其在上皮細胞陽性反應(yīng)更加明顯(圖4A～C)。光密度定量分析結(jié)果顯示，NSE活性在后腸中最強，在中腸次之，在前腸中最弱，且3個腸段之間具有顯著性差異(P<0.05)(表1)。

表1 建鯉腸道中4種酶活性(ODM)的分布

2.2 AB-PAS染色

AB-PAS染色結(jié)果顯示：建鯉腸道中分布3種類型黏液細胞，這些黏液細胞均呈橢圓形，散布在整個腸道的上皮細胞和固有層中(圖5A～C)；Ⅰ型黏液細胞呈藍紫色，Ⅱ型黏液細胞呈紫紅色，Ⅲ型黏液細胞呈深藍色(圖5D～F)。建鯉腸道中3種不同類型黏液細胞的分布數(shù)量占比見表2，Ⅰ型黏液細胞在前腸中數(shù)量最多(P<0.05)，后腸中最少，且中、后腸間無顯著性差異(P>0.05)；Ⅱ型黏液細胞在中腸中數(shù)量最多(P<0.05)，在前腸中最少；Ⅲ型黏液細胞數(shù)量在前腸中最多，在中腸中最少，且前腸與中腸之間具有顯著性差異(P<0.05)。此外，前腸中Ⅰ型黏液細胞數(shù)量最多，Ⅲ型黏液細胞次之，Ⅱ型黏液細胞最少，且3種類型的黏液細胞數(shù)量存在顯著性差異(P<0.05)；中腸中Ⅰ型黏液細胞數(shù)量最多，Ⅱ型黏液細胞次之，Ⅲ型黏液細胞最少，且3種類型的黏液細胞數(shù)量存在顯著性差異(P<0.05)；后腸中Ⅰ型黏液細胞數(shù)量最多(P<0.05)，Ⅱ型和Ⅲ型黏液細胞較少。

表2 建鯉腸道不同類型黏液細胞數(shù)量占比

在前腸(A)、中腸(B)、后腸(C)中黏液細胞廣泛分布,箭頭示各種黏液細胞;D為前腸中3種黏液細胞(a—Ⅰ型黏液細胞，b—Ⅱ型黏液細胞，c—Ⅲ型黏液細胞)；E為中腸中3種黏液細胞(a—Ⅰ型黏液細胞，b—Ⅱ型黏液細胞，c—Ⅲ型黏液細胞)；F為后腸中3種黏液細胞(a—Ⅰ型黏液細胞，b—Ⅱ型黏液細胞，c—Ⅲ型黏液細胞)。LP—固有層；EP—上皮細胞；MM—黏膜肌層。

3 討論

本研究中首次觀察了建鯉腸道內(nèi)ACP、ALP、POD、NSE的組織分布及黏液細胞類型，建鯉腸道中普遍存在這4種胞內(nèi)酶和3種類型的黏液細胞，但不同部位的酶活性與黏液細胞數(shù)量存在差異。

3.1 4種胞內(nèi)酶在不同腸段中的分布

ACP是溶酶體的一種標(biāo)志酶，在體內(nèi)直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移與代謝。腸道中ACP在營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和運轉(zhuǎn)過程中發(fā)揮重要作用，特別是其可以通過催化磷蛋白的水解，廣泛參與蛋白質(zhì)胞內(nèi)消化和胞飲作用的過程[16-17]。本研究中，ACP在腸道上皮細胞核上區(qū)和固有層中廣泛分布，這與在錦鯉[8]、褐菖鲉Sebastiscusmarmoratus[18]及歐洲鰻鱺Anguillaanguilla[19]中觀察到的結(jié)果相似；而且建鯉中腸中ACP活性顯著高于前腸和后腸，推測其中腸部位具有較強的蛋白質(zhì)消化吸收功能。

ALP是一種在動物體內(nèi)廣泛分布的非特異性磷酸水解酶，通過主動運輸方式參與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。腸道中ALP活性與脂類的吸收能力存在正相關(guān)關(guān)系，一般可把ALP作為脂類等營養(yǎng)物質(zhì)吸收的標(biāo)志酶[20]。本研究中，在整個腸道上皮紋狀緣與中腸的柱狀上皮中發(fā)現(xiàn)大量ALP活性，這與對歐洲鰻鱺[19]、團頭魴Megalobramaamblycephala[21]和無須鱈Merlucciusmerluccius[22]的研究結(jié)果一致，表明這些部位具有較強的脂類吸收功能。此外，在肌層和肌層與黏膜下層的交界處也發(fā)現(xiàn)大量ALP活性，這一結(jié)果可能與ALP參與物質(zhì)的跨膜運輸有關(guān)[23-24]。ALP活性在建鯉中腸中最高，而在半滑舌鰨[7]前腸中卻最高，這種結(jié)果的不同可能與不同食性魚類腸道不同部位功能分化差異有關(guān)。

POD是一種具有免疫防御功能的氧化還原酶，其可以催化細胞內(nèi)有害物質(zhì)與H2O2反應(yīng)，生成無害的小分子氧化酚類和胺類等物質(zhì)，發(fā)揮殺傷病原微生物的作用，同時降低細胞內(nèi)H2O2和有機過氧化物的水平，起到保護宿主細胞的作用[22,25]。本研究中，POD活性廣泛存在于整個腸道黏膜的固有層和黏膜肌層中，這與在錦鯉[8]中觀察到的結(jié)果一致。POD活性在建鯉的后腸中最高，推測這與魚類后腸承擔(dān)較為重要的免疫防御功能有關(guān)。

NSE是參與脂類物質(zhì)代謝并促進其消化吸收的一種水解酶[2,15]。本研究中，NSE分布于建鯉整個腸道組織的上皮細胞，表明這些細胞與魚類脂類物質(zhì)的代謝關(guān)系密切[20]。此外，在建鯉腸道中，NSE活性在后腸中最高，其次是中腸和前腸，這與在雜食性魚類如錦鯉[8]、無須鱈[22]中觀察到的結(jié)果一致。由此推測，NSE在腸道組織中的這一分布特點可能在雜食性魚類中普遍存在。

3.2 黏液細胞在不同腸段中的分布

黏液細胞依據(jù)著色差異及細胞形態(tài)被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3種類型。Ⅰ型黏液細胞對AB和PAS呈陽性反應(yīng)，表明其存在中性黏蛋白和酸性黏蛋白。Ⅱ型黏液細胞只對PAS呈陽性反應(yīng)，表明其存在糖原、中性黏蛋白和糖蛋白。Ⅲ型黏液細胞只對AB呈陽性反應(yīng)，表明其存在硫黏蛋白、唾液黏蛋白、蛋白多糖和透明質(zhì)酸。本研究中，這3種黏液細胞散布于建鯉整個腸道的上皮細胞與固有層中，這與在大多數(shù)魚類如錦鯉[8]、歐洲鰻鱺[26]、歐鲇Silurusglanis[27]中觀察到的結(jié)果一致。

酸性黏液物質(zhì)具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運與潤滑消化道的功能，并維持消化道一定的酸性環(huán)境；中性黏液物質(zhì)主要起保護消化道上皮作用。本研究中，Ⅰ型和Ⅲ型黏液細胞在前腸中顯著多于Ⅱ型細胞，表明前腸中酸性黏液物質(zhì)分泌較多，這有助于魚類前腸高效地執(zhí)行其消化功能。建鯉中腸中黏液細胞分布情況與對黃姑魚Nibeaalbiflora[28]的研究結(jié)果一致，均分布有豐富的Ⅰ型和Ⅱ型黏液細胞，故推測建鯉中腸中含有豐富中性黏蛋白和少量酸性黏多糖。這說明消化吸收功能在建鯉前腸和中腸產(chǎn)生分化，少量酸性黏多糖和大量中性黏蛋白可能預(yù)示著中腸的消化作用減弱，而吸收功能增強。后腸內(nèi)黏液細胞數(shù)量最少，主要含Ⅰ型黏液細胞。魚類后腸容易受到細菌和其他病原體感染，推測建鯉后腸酸性黏液物質(zhì)和中性黏液物質(zhì)共同參與免疫防御作用。

4 結(jié)論

1)ACP、ALP、POD、NSE 4種胞內(nèi)酶在建鯉腸道組織中廣泛存在，但腸道不同部位的酶活性強弱及分布具有不同特點。

2)在建鯉腸道組織中觀察到3種類型的黏液細胞(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型)，主要散布于整個腸道的上皮細胞與固有層中，其數(shù)量和相對豐度在不同腸段中具有明顯差異。

3)4種胞內(nèi)酶和黏液細胞在建鯉腸道組織中的分布特點與其腸道的生理功能分化密切相關(guān)。