曾江琴,孫勤國,徐鴻婕,丁曉明,牟艷杰,蔣躍文

(1.武漢市第三醫(yī)院中醫(yī)科,武漢 430060;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué),武漢 430061)

高血脂癥(hyperlipdemia,HLP)是一種因體內(nèi)血脂水平過高引發(fā)的全身性脂質(zhì)代謝紊亂疾病[1],常見于中老年人,隱匿性強(qiáng),沒有明顯的臨床癥狀,但長期得不到改善會誘發(fā)冠心病、動脈粥樣硬化等一系列心腦血管疾病[2-3]。 有研究表明,HLP 極易損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞,造成血管內(nèi)皮功能障礙,進(jìn)而加重心腦血管疾病[4]。 中醫(yī)認(rèn)為,HLP 的核心發(fā)病機(jī)制為痰瘀阻絡(luò)[5-6],以化痰祛瘀通絡(luò)方能向愈[7]。小陷胸湯由黃連、瓜蔞、半夏三味藥組成,黃連降火結(jié)熱,瓜蔞潤燥滌垢,半夏散結(jié)豁痰,合之以清熱化痰、寬胸散結(jié)[8-9]。 本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)制作小鼠HLP 模型,初步探索小陷胸湯對HLP 小鼠血管內(nèi)皮的保護(hù)作用,以期為HLP 的臨床防治提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

36 只 SPF 級 C57BL/6 小鼠,雄性,5 周齡,體重20~22 g,于SPF 級條件下飼養(yǎng)。 小鼠由三峽大學(xué)實驗動物中心[SCXK(鄂)2017-0012],動物實驗在武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司動物中心進(jìn)行[SYXK(鄂)2018-0104],飼養(yǎng)溫度 22℃ ~26℃,相對濕度50%~60%,循環(huán)光照。 本研究動物實驗方案合理,符合實驗動物的“3R”原則,經(jīng)武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司倫理審查委員會批準(zhǔn)(HLK-20190106-01)。

1.2 主要儀器與試劑

小陷胸湯由黃連3 g,瓜蔞30 g,半夏12 g 三方組成,武漢市第三醫(yī)院中藥房提供。 使用傳統(tǒng)方法經(jīng)浸泡、煎煮、過濾、濃縮等步驟制成煎劑,分別調(diào)制成每毫升含生藥 0.03 g、0.06 g、0.12 g 湯劑,低溫冷藏待用。

洛伐他丁(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,中國,批號:Lot#c1925105);高脂飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司,中國,批號:D12492);蘇木精、伊紅、中性樹脂、DAB 顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,中國,批號:G1140、E8090、G8590、DA1010-2);蛋白質(zhì) Marker(thermo,美國,批號:26634);RIPA(強(qiáng))組織細(xì)胞快速裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、兔抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體、兔抗酪氨酸蛋白激酶Eph 受體B4(EPH receptor B4,EphB4)及其胞膜附著型配體 B2(Ephrin-B2,EphrinB2) 抗體(bioswamp,中國,批號:W1689、W1712、PAB43958、PAB33625、PAB41809);SYBR Green PCR 試劑盒(KAPA Biosystems,美國,批號:KM4101);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,中國,批號:639505)。

正置顯微鏡、石蠟切片機(jī)(Leica,德國,型號:DM1000);生物組織包埋機(jī)(湖北泰維科技實業(yè)股份有限公司,中國,型號:TB-718D);自動組織脫水機(jī)(湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司,型號:TKD-TSF);酶標(biāo)儀(Ladsystems,美國,型號:MK3);電泳儀(BIO-RAD,美國,型號:mini protean 3 cell);PCR 儀(杭州柏恒科技有限公司,中國,型號:GE48527)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HLP 小鼠模型的建立、分組和給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后,對照組6 只采用正常飼料喂養(yǎng),剩余小鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)8 周。 將高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠隨機(jī)分為5 組:模型組(0.5 mL 生理鹽水)、低劑量組(0.03 g/mL 小陷胸湯)、中劑量組(0.06 g/mL 小陷胸湯)、高劑量組(0.12 g/mL 小陷胸湯)和陽性對照組(2.5 mg/kg 洛伐他丁),每組6只,給予相應(yīng)藥物灌胃治療,每日1 次。 每天觀察大鼠的毛發(fā)狀態(tài)、攝食量、飲水量、活動量等變化,每周測一次體重。 8 周后,采用1%戊巴比妥鈉麻醉后取血,分離血清,處死小鼠,收集脾、肝(稱重)、主動脈血管組織,保存待測。

1.3.2 HE 染色觀察

將小鼠主動脈組織固定,脫水,包埋成蠟塊,切至3 μm,切片脫蠟,復(fù)水,水洗;蘇木精染色3~6 min,水洗;1%鹽酸乙醇1~3 s,水洗;促藍(lán)液返藍(lán)5~10 s,沖洗15~30 min;0.5%伊紅染色2~3 min,水洗;80%乙醇15~30 s,95%乙醇15~30 s;無水乙醇1~3 s;二甲苯透明,中性樹脂固封;顯微鏡下拍照觀察。

1.3.3 免疫組化染色觀察

主動脈血管組織制作切片,脫蠟至水,自來水沖洗10 min;0.01 mol/L 檸檬酸鈉高壓修復(fù)20 min,PBS 沖洗 3 min×3 次;3% H2O2濕盒孵育 10 min,PBS 沖洗3 min×3 次;10%山羊血清濕盒孵育30 min,PBS 沖洗3 min×3 次;滴加兔抗血管假性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)抗體,4℃濕盒孵育過夜,PBS 沖洗 3 min×3 次;室溫下修復(fù) 40 min,PBS 沖洗 5 min×3 次;滴加 maxvision 二抗,濕盒孵育 1 h,PBS 沖洗 3 min×3 次;DAB 染色,自來水沖洗;蘇木素復(fù)染3 min,1%鹽酸乙醇分化,自來水沖洗,乙醇脫水后二甲苯透明3 min×2 次,封片;顯微鏡下拍照觀察,分別測量出血管組織中陽性區(qū)面積、陽性區(qū)積分光密度,計算陽性區(qū)域平均光密度值(average optical density,AOD)= 陽性區(qū)積分光密度/陽性區(qū)面積。

1.3.4 Western blot 檢測

提取主動脈組織蛋白并定量,取20 μg 蛋白置于80 V 下預(yù)電泳40 min,再在120 V 下電泳50 min;采用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜的方式在90 V 下轉(zhuǎn)膜50 min,5%脫脂奶粉封閉 2 h;滴加兔抗 EphB4 抗體(1 ∶1000)、 兔 抗 EphrinB2 抗體 (1 ∶1000)、 兔抗VEGF 抗體(1 ∶500)和膜 4℃孵育過夜;PBST 洗滌 5 min×3 次;加二抗室溫孵育1 h;PBST 洗滌5 min×3 次,滴加ECL 發(fā)光液顯影,讀取灰度值。

1.3.5 qRT-PCR 檢測

取主動脈組織樣本,按照試劑盒說明書步驟提取總RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增,以cDNA 為模板進(jìn)行Real-time PCR,反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性3 min,95℃變性5 s,56℃退火10 s,72℃延伸25 s,39 個循環(huán)。見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,計量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,單因素方差分析法分析多組間的差異,P<0.05 表示差異顯著,有統(tǒng)計學(xué)意義;采用Leica Application Suite 圖象系統(tǒng)采集主動脈血管組織圖片。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀態(tài)及體重變化

給藥期間,正常組小鼠攝食量、飲水量和活動量均正常,毛發(fā)光亮;模型組小鼠攝食量和活動量減少,毛發(fā)較差。 低、中、高劑量組和洛伐他丁組小鼠行為狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)。

如表2 所示,與對照組比較,8 周末模型組小鼠體重顯著增加(P<0.05);與模型組比較,8 周末小陷胸湯各劑量組、洛伐他丁組均有顯著性降低(P<0.05)。

表2 小鼠體重的變化(g)Table 2 Changes of body weight in mice

2.2 小鼠主動脈血管組織病理形態(tài)學(xué)觀察

如圖1 所示,對照組小鼠主動脈組織外、中、內(nèi)三層結(jié)構(gòu)清晰完整,排列緊密有序;模型組主動脈內(nèi)膜增厚,中層平滑肌細(xì)胞排列紊亂,彈力纖維出現(xiàn)明顯斷裂;低、中、高劑量組和洛伐他丁組內(nèi)皮組織結(jié)構(gòu)及狀態(tài)均有不同程度改善。

圖1 小鼠主動脈HE 染色Figure 1 HE staining of aorta in mice

2.3 小陷胸湯對HLP 小鼠主動脈組織vWF 含量的影響

如圖2 所示,與對照組比較,模型組小鼠主動脈vWF 表達(dá)顯著增加(P<0.05);與模型組比較,小陷胸湯中、高劑量組和洛伐他丁組vWF 表達(dá)顯著減少(P<0.05)。

圖2 小鼠主動脈組織中vWF 的表達(dá)Note. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05.Figure 2 Expression of vWF in aorta of mice

2.4 小陷胸湯對HLP 小鼠主動脈組織中EphB4、EphrinB2 和VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)的影響

如圖3 和圖4 所示,與對照組比較,模型組小鼠EphB4、EphrinB2、VEGF 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,低、中、高劑量組和洛伐他丁組小鼠 EphB4、 EphrinB2、 VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與低劑量組比較,中劑量和高劑量組小鼠主動脈組織中EphB4、EphrinB2、VEGF mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。

圖3 小鼠主動脈組織中EphB4、EphrinB2 和VEGF 的mRNA 水平Note. Compared with the control group, *P< 0.05. Compared with the model group, #P< 0.05.Compared with the low-dose group, &P<0.05.Figure 3 Levels of EphB4, EphrinB2 and VEGF mRNA in aorta of mice

圖4 小鼠主動脈組織中EphB4、EphrinB2 和VEGF 蛋白的表達(dá)Note. 1, Control group. 2, Model group; 3, Low-dose group. 4, Medium-dose group. 5, High-dose group. 6, Lovastatin group. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05. Compared with the lowdose group, &P<0.05.Figure 4 Expression of EphB4, EphrinB2 and VEGF protein in aorta of mice

3 討論

HLP 是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要病理基礎(chǔ),也是造成心腦血管病變的主要因素,嚴(yán)重危害著人類的身體健康。 血管內(nèi)皮功能障礙與眾多心血管疾病關(guān)系密切[10]。 血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液和管壁組織之間的第一通透性屏障,在抗凝、抗血小板聚集和維持血液通道等方面發(fā)揮作用。 長期高血脂會促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生自由基,氧化生物膜內(nèi)的不飽和脂肪酸,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷,引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[11]。 因此,治療HLP 應(yīng)重視對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的改善。 小陷胸湯最早出自張仲景的《傷寒論》,取黃連、半夏、瓜蔞入藥,此方辛開苦降[12],具有清熱化痰、寬胸散結(jié)之功。 本研究以HLP 小鼠模型為研究對象,證明了各劑量的小陷胸湯可不同程度改善HLP 小鼠的飲食量和活動量,也顯著改善了小鼠主動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)損傷、平滑肌細(xì)胞排列紊亂程度,提示小陷胸湯對HLP 小鼠血管內(nèi)皮具有保護(hù)作用。

vWF 是一種由內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的多聚糖蛋白,正常生理狀態(tài)下儲存在胞質(zhì)內(nèi)的Weibelpalade 小體中,內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時會釋放過度的vWF,激活血小板,引發(fā)血栓的形成[13],因此vWF被認(rèn)為是內(nèi)皮受損的特異性標(biāo)志物[14]。 在本研究中,HLP 小鼠vWF 表達(dá)明顯增加,提示高血脂癥造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷,而經(jīng)小陷胸湯治療可以下調(diào)vWF的表達(dá),提示小陷胸湯能緩解內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

EphB4/EphrinB2 雙向信號通路在血管新生中的意義重大,EphB4 在靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上特異性地表達(dá),而 EphrinB2 特異性地表達(dá)在動脈內(nèi)皮細(xì)胞上[15]。 蔡金等[16]通過清腦益髓調(diào)督法電針治療急性腦梗死發(fā)現(xiàn),該法通過上調(diào)EphrinB2 表達(dá),促進(jìn)血管新生進(jìn)而對腦梗死起到治療的作用。 Noren等[17]研究表明,在MOPC315 腫瘤模型中,新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的磷酸化EphrinB2 表達(dá)量較高,其與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的EphB4 相互作用并促進(jìn)血管的新生。 VEGF 是血管新生的主要調(diào)控因子,能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂。 張振強(qiáng)等[18]研究表明HLP 病理條件會刺激大鼠腦組織VEGF 的表達(dá)以促進(jìn)新生血管的形成。 研究表明,高血脂癥誘發(fā)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)的機(jī)制之一是促進(jìn)血管的生成[19],因此可通過促進(jìn)血管生成因子的變化判斷高血脂癥導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷的程度。 在本研究結(jié)果中,HLP 小鼠 EphB4、EphrinB2 和 VEGF mRNA 水平增加,提示高血脂癥誘發(fā)了機(jī)體內(nèi)源性保護(hù),促進(jìn)血管的生成,小陷胸湯治療后的HLP 小鼠中EphB4、EphrinB2 和VEGF mRNA 及蛋白表達(dá)水平下降,且中、高劑量組 EphB4、EphrinB2 和 VEGF mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著低于低劑量組,存在一定的劑量依賴性,提示新生血管減少,進(jìn)一步提示小陷胸湯能改善高血脂癥引起的病理反應(yīng),抑制高血脂癥的發(fā)展。

綜上所述,通過高血脂癥導(dǎo)致的小鼠行為變化、主動脈血管組織病變程度及各因子表達(dá)水平可判斷小陷胸湯具有緩解高血脂癥誘導(dǎo)病理反應(yīng),改善血管內(nèi)皮損傷的功效,后續(xù)可進(jìn)一步分析其具體的機(jī)制。