趙琦琦 李奕昕 焦倩 姜宏

[摘要] 目的 探討不同濃度載脂蛋白D（Apo D）對體外培養(yǎng)的小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細胞（NSCs）細胞活力的影響。

方法 體外培養(yǎng)小鼠胚胎（14 d）大腦皮質(zhì)NSCs;采用神經(jīng)球直徑大小測量和cell counting kit（CCK-8）細胞增殖試劑盒，檢測不同濃度Apo D處理后NSCs細胞活力和增殖的改變。

結(jié)果 分離培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)NSCs能增殖形成神經(jīng)球，不同濃度（2、4、8、16、32 nmol/L）Apo D均可增加細胞活力（F=37.66，P<0.001），以2 nmol/L Apo D增加細胞活力的作用最明顯。

結(jié)論 Apo D可增加NSCs細胞活力，促進NSCs增殖。

[關(guān)鍵詞] 神經(jīng)干細胞;載脂蛋白D類;細胞增殖

[中圖分類號] R338.1

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）05-0653-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.133

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210628.1659.015.html;2021-06-29 13：23：42

EFFECT OF APOLIPOPROTEIN D ON THE PROLIFERATION OF NEURAL STEM CELLS

ZHAO Qiqi， LI Yixin， JIAO Qian， JIANG Hong

（State Key Disciplines： Physiology （in Incubation）， Department of Physiology， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of different concentrations of apolipoprotein D （Apo D） on the viability of mouse cortical neural stem cells （NSCs） cultured in vitro.

Methods Cortex NSCs were isolated from the cerebral cortex of mouse embryos on embryonic day 14 and were cultured in vitro， and measurement of neurosphere diameter and CCK-8 assay were performed to investigate the changes in the viability and proliferation of NSCs after treatment with different concentrations of Apo D.

Results The cortical NSCs isolated and cultured in vitro could proliferate to form neurospheres， and different concentrations （2，4，8，16， and 32 nmol/L） of Apo D increased cell viability （F=37.66，P<0.001）， among which 2 nmol/L Apo D had the most significant effect on increasing cell viability.

Conclusion Apo D can increase the viability of NSCs and promote the proliferation of NSCs.

[KEY WORDS] neural stem cells; apolipoprotein D; cell proliferation

神經(jīng)干細胞（NSCs）是具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞[1-4]。由于NSCs在特定條件和因子誘導(dǎo)下可以定向分化成不同類型神經(jīng)細胞，NSCs移植可以彌補丟失的神經(jīng)元，成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病細胞替代治療的可行性方案之一，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病和神經(jīng)損傷等提供了新的治療策略[2，4-5]。因此，對NSCs增殖、分化調(diào)控的研究是揭示臨床上常見中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷疾病致病機制的關(guān)鍵，同時也為一些神經(jīng)障礙疾病的治療提供新思路。

載脂蛋白D（Apo D）1963年首次發(fā)現(xiàn)于血漿高密度脂蛋白（HDL）中，是具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)運功能的分泌型糖蛋白[6]。Apo D是一種分子量為29 000的糖蛋白，作為載脂蛋白家族成員之一，其在體內(nèi)分布廣泛，在腎臟、脾臟、睪丸和大腦中均具有高水平的表達[6-7]。在人類和其他哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Apo D主要表達于膠質(zhì)細胞及其前體[8-9]，也可由神經(jīng)元表達[10]。Apo基因是在衰老的大腦、神經(jīng)退行性疾病和精神疾病中始終過量表達的少數(shù)基因之一[10-12]。大量研究結(jié)果表明，在衰老和多種神經(jīng)系統(tǒng)功能失調(diào)疾病中Apo D的含量明顯增高[10-11，13]，Apo D的增加主要見于星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和損傷區(qū)的少突膠質(zhì)細胞。相關(guān)研究已表明，在衰老或病理條件下的果蠅模型中，Apo D可降低體內(nèi)因活性氧積累而升高的脂質(zhì)過氧化物水平[14]。本實驗室前期研究顯示，Apo D對多巴胺能神經(jīng)元具有神經(jīng)保護作用，其保護作用可能與抗氧化應(yīng)激有關(guān)。但Apo D對NSCs增殖的作用未見報道。故本研究通過體外培養(yǎng)大腦皮質(zhì)NSCs、外源性給予Apo D的方法，觀察不同濃度的Apo D對大腦皮質(zhì)NSCs細胞活力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

C57BL/6小鼠（購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），Apo D（Biovendor公司），DMEM/F12培養(yǎng)液（Hyclone公司），表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、N-2 supplement、B-27 supplement和胎牛血清（Gibco公司），cell counting kit（CCK-8）試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 大腦皮質(zhì)NSCs的分離培養(yǎng) 取孕14 d的C57BL/6小鼠胚胎大腦皮質(zhì)部位組織，機械剪碎和吹打后過濾離心，細胞計數(shù)后種植在75 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于溫度37 ℃、含有體積分數(shù)0.05 CO2的孵箱中，使用含有DMEM/F12（1∶1）、體積分數(shù)0.02 N-2 supplement、體積分數(shù)0.01 B-27 supplement、10 μg/L bFGF、20 μg/L EGF、10 g/L青霉素-鏈霉素混合液的完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。NSCs培養(yǎng)4～5 d時進行傳代，傳代至第3代時，以1×106/L密度種植于多聚賴氨酸包被的玻片上，使用含體積分數(shù)0.01胎牛血清的分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，7 d后經(jīng)預(yù)冷的40 g/L多聚甲醛固定30 min，免疫熒光染色后觀察NSCs分化情況。

1.2.2 NSCs的鑒定 NSCs貼壁培養(yǎng)7 d后，用多聚甲醛固定細胞，加入含體積分數(shù)0.01山羊血清的封閉液，室溫封閉1 h;加入Nestin、Ki67、β-tubulin Ⅲ和GFAP抗體，4 ℃孵育過夜;用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min;加入熒光二抗室溫孵育1 h，DAPI室溫染色5 min;用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min;封片，熒光顯微鏡下觀察并拍攝熒光圖像。

1.2.3 細胞活力檢測 將第3代的皮質(zhì)NSCs傳代種植于96孔板，每孔100 μL，種植密度為1×105/L，以不同濃度（0、2、4、8、16和32 nmol/L）Apo D培養(yǎng)5 d，檢測第5天時的NSCs細胞活力。在測定前2～4 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，于酶標儀（PerkinElmer，Victor nivo）上檢測，以450 nm波長處的吸光度（A）值反映細胞活力。

1.2.4 神經(jīng)球直徑測量 將傳至第3代大腦皮質(zhì)NSCs以1×108/L密度種植于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)1～5 d，于光鏡下觀察并拍攝圖像。利用NIS-Elements軟件測量培養(yǎng)1～5 d形成的神經(jīng)球直徑。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，繼以Tukey法進行組間兩兩比較;兩組比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 NSCs的培養(yǎng)與鑒定

大腦皮質(zhì)NSCs培養(yǎng)3 d時可增殖成直徑40～70 μm的神經(jīng)球;培養(yǎng)5 d時可增殖為直徑100～150 μm的神經(jīng)球（圖1A）。神經(jīng)球免疫雙標染色結(jié)果顯示，Nestin和Ki67陽性（圖1B、C）。大腦皮質(zhì)NSCs誘導(dǎo)分化7 d后，出現(xiàn)β-tubulin Ⅲ陽性的神經(jīng)元和GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞（圖1D）。

2.2 Apo D對NSCs細胞活力的影響

NSCs經(jīng)2、4、8、16和32 nmol/L的Apo D培養(yǎng)5 d，檢測細胞活力的A值分別為0.195±0.005、0.181±0.004、0.188±0.004、0.185±0.005和0.167±0.005。與對照組（0.150±0.003）相比較，2、4、8、16和32 nmol/L Apo D處理組NSCs細胞活力均顯著增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（n=5，F(xiàn)=37.66，P<0.001），其中2 nmol/L Apo D處理組NSCs細胞活力增高最明顯，表明低濃度Apo D對NSCs細胞活力的影響較高濃度Apo D顯著。見圖2。

2.3 Apo D對神經(jīng)球直徑的影響

NSCs經(jīng)2 nmol/L Apo D培養(yǎng)5 d，神經(jīng)球直徑為（55.142±0.393）μm，與對照組的（49.912±3.256）μm相比，2 nmol/L Apo D處理組NSCs形成的神經(jīng)球直徑增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=6，t=2.841，P<0.05）。

3 討? 論

NSCs具有自我更新和多向分化潛能。當神經(jīng)退行性病變或中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷時，NSCs會向損傷部位遷移并替代受損細胞[15]，從而在很大程度上恢復(fù)功能，這為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來了希望的曙光。但是，由于成人內(nèi)源性NSCs很少，這種內(nèi)源性激活顯然不足以達到治療目的。因此，NSCs的增殖研究成為細胞治療的一個關(guān)鍵問題。

體外培養(yǎng)的小鼠胚胎大腦皮質(zhì)NSCs可增殖形成神經(jīng)球，且隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量增多、體積增大。本研究免疫熒光染色結(jié)果顯示，NSCs培養(yǎng)至第5天時，神經(jīng)球內(nèi)細胞呈Nestin陽性，說明分裂增殖的NSCs仍具有祖細胞的特性。此外，NSCs還有分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的能力。本研究免疫熒光染色結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的小鼠胚胎大腦皮質(zhì)NSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化7 d后，出現(xiàn)β-tubulinⅢ陽性和GFAP陽性細胞，提示NSCs分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞，證實了大腦皮質(zhì)NSCs的多向分化潛能。

NSCs的增殖受多種因素的影響，除受內(nèi)在基因的調(diào)控外，還受周圍包括細胞因子等微環(huán)境的影響[2，16-17]。Apo D是血漿HDL的一種成分，在人類胎盤、卵巢、睪丸、腦、胰腺和腎上腺中表達水平較高[18]，在老年人的神經(jīng)膠質(zhì)細胞和老年病病人的神經(jīng)元中豐富表達[9，19]。既往研究表明，Apo D參與免疫反應(yīng)、細胞凋亡、胚胎的發(fā)育和分化、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生和損傷修復(fù)以及腫瘤發(fā)生等生命活動和過程[12]。Apo D缺陷小鼠對氧化應(yīng)激的敏感性及腦脂質(zhì)過氧化的水平明顯增高，而Apo D過表達小鼠存活率增高并能抑制氧化劑作用后腦脂質(zhì)過氧化物

的增加[20]，表明Apo D在應(yīng)激應(yīng)答中起保護作用，這可能與抗氧化有關(guān)。此外，在神經(jīng)退行性疾病（例如阿爾茨海默?。┎∪说闹車窠?jīng)再生部位和腦脊液中Apo D也高濃度表達，提示Apo D可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的保護和修復(fù)[6]。本研究結(jié)果證實，不同濃度Apo D均可顯著提高體外培養(yǎng)的大腦皮質(zhì)NSCs細胞活力。Apo D對大腦皮質(zhì)NSCs細胞活力的影響并不具有濃度依賴的特點，這可能是由于不同濃度的Apo D對神經(jīng)系統(tǒng)或細胞產(chǎn)生不同生理效應(yīng)導(dǎo)致的。Apo D對神經(jīng)系統(tǒng)的具體作用還需要進一步的研究。

綜上所述，Apo D可以提高NSCs的細胞活力，增強細胞的存活和增殖能力，進而影響神經(jīng)再生。

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（本文編輯 馬偉平）