不同來源威靈仙抗炎鎮(zhèn)痛譜效關(guān)系研究

鞠成國，張 強(qiáng)，唐婷婷，王 巍*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連116600； 2.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600）

威靈仙始載于《新修本草》，味辛、咸，性溫，其性猛善走，通行十二經(jīng)脈，具有很好的祛風(fēng)濕、通經(jīng)止痹痛的功效[1]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明威靈仙在抗炎鎮(zhèn)痛方面有很好的療效[2-3]。2020 年版 《中國藥典》（一部）規(guī)定威靈仙為毛茛科植物威靈仙Clematis chinensisOsbeck、棉團(tuán)鐵線蓮Clematis hexapetalaPall.或東北鐵線蓮Clematis manshuricaRupr.的干燥根和根莖[4]?，F(xiàn)代化學(xué)成分研究表明威靈仙含有大量的皂苷類成分[5]，因基原不同，其化學(xué)成分間亦存在一定差別。由于成分決定療效，因此不同基原威靈仙的抗炎鎮(zhèn)痛效果勢必有所不同。本研究旨在對不同基原威靈仙進(jìn)行藥效學(xué)及化學(xué)成分進(jìn)行比較，并構(gòu)建藥效與化學(xué)成分的譜效關(guān)系，為威靈仙抗炎鎮(zhèn)痛的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供支持，并為威靈仙飲片的炮制加工及臨床合理用藥提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試藥

S0-1 為威靈仙對照藥材、S0-2 為棉團(tuán)鐵線蓮對照藥材（均購自中國食品藥品檢定研究院，批號分別為121189-201102、121578-201202）；S1-S11 批威靈仙藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定，均為正品，信息見表 1；阿司匹林腸溶片（北京曙光藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：20140607）。

表 1 樣品信息Tab. 1 Information of samples

1.2 動物

SPF 級昆明小鼠，雄性［購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，動物許可證號為：SCXK（遼）2020-0001］，體質(zhì)量為（20±2）g。

1.3 試劑

二甲苯、冰醋酸為化學(xué)級，均購自成都市科龍化工試劑廠；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，均購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。

1.4 儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜系統(tǒng)（美國安捷倫科技公司）；FA1004B 型分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 威靈仙給藥溶液及陽性藥溶液制備 分別稱取各批次藥材適量，加8 倍量、6 倍量水，水煎提取兩次，每次1 h，合并濾液，濾液蒸干研細(xì)備用。取適量干粉，加水混溶，制成濃度為0.13 g/mL 的威靈仙混懸液；取阿司匹林腸溶片，用研缽研磨成細(xì)粉狀，稱取粉末適量，加水制成0.01 g/mL 的阿司匹林混懸液[6]。

1.5.2 耳腫脹抗炎實(shí)驗(yàn) 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成14 組，每組10 只。即空白組、模型組、阿司匹林組、威靈仙S1-S11 組。各批次威靈仙及阿司匹林組灌胃相應(yīng)給藥液0.4 mL/20 g，空白組和模型組灌胃等量的水，各組均連續(xù)灌胃給藥7 d。除空白組外，其余各組小鼠末次給藥1 h 后，于右耳前后兩面涂抹20 μL 二甲苯致炎。1 h 后脫頸椎處死小鼠，用直徑8 mm 的打孔器沿耳緣沖下耳廓，左右兩耳取同一部位，分別置于分析天平上稱其質(zhì)量，計(jì)算鼠耳腫脹度及抑制率[7]。小鼠耳腫脹度（%） =（小鼠致炎耳片質(zhì)量－小鼠未致炎耳片質(zhì)量）/小鼠未致炎耳片質(zhì)量×100%；腫脹抑制率（%）=（模型組小鼠致炎后耳片平均腫脹度-給藥組小鼠致炎后耳片平均腫脹度）/模型組小鼠致炎后耳片平均腫脹度×100%。

1.5.3 冰醋酸扭體鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 小鼠分組及給藥方法同“1.5.2”項(xiàng)。末次給藥1 h 后，除空白組外各組小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸溶液0.2 mL。記錄給藥后15 min 內(nèi)各小鼠扭體（腹部凹陷、伸展后肢、臀部抬高）次數(shù)，計(jì)算扭體抑制率[8]。扭體抑制率（%） =（模型組小鼠15 min 內(nèi)平均扭體次數(shù)－給藥組小鼠15 min 內(nèi)平均扭體次數(shù)）/模型組小鼠15 min 內(nèi)平均扭體次數(shù)×100%。

1.5.4 HPLC 指紋圖譜建立 （1）供試品溶液制備

取“1.5.1”項(xiàng)下預(yù)留威靈仙干粉，精密稱取0.4 g，置于100 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，過0.45 μm 微孔濾膜，即得[9]。

（2）色譜條件 Diamonsil Plus C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），梯度洗脫（0 ～8 min，95%～95%B；8 ～15 min，95%～88%B；15 ～40 min，8%～80%B；40 ～60 min，80%～75%B；60 ～70 min，5%～70%B；70 ～80 min，70%B；80 ～95 min，70% ～55%B；95 ～110 min，55%～10%B；110 ～115 min，10%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：205 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL[10]。

（3）方法學(xué)考察 取S1 供試品溶液，按“1.5.4（2）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)6 次，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間、共有峰峰面積及色譜圖的相似度，考察設(shè)備精密度；取S1 供試品溶液，分別在制備后的0、2、4、8、12、16、24 h 時(shí)， 按“1.5.4（2）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間、共有峰峰面積及色譜圖的相似度，考察24 h 內(nèi)樣品穩(wěn)定性；取0.1 g 的S1 藥材干粉6 份，按上述方法操作，制備供試品溶液，按“1.5.4（2）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間、共有峰峰面積及色譜圖的相似度，考察方法重復(fù)性。

1.5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。偏最小二乘回歸分析采用MINITAB 17 軟件。

2 結(jié)果

2.1 抗炎鎮(zhèn)痛作用結(jié)果

與模型組比較，阿司匹林組及各批次威靈仙組均明顯降低小鼠耳腫脹度（P< 0.05），提高腫脹抑制率（P< 0.05），減少扭體次數(shù)率（P< 0.05），增強(qiáng)扭體抑制率（P< 0.05）。結(jié)果見表2。

表 2 各組小鼠抗炎鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n = 10）Tab.2 Experimental results of anti inflammation and analgesia in mice of each group（±s，n = 10）

表 2 各組小鼠抗炎鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s，n = 10）Tab.2 Experimental results of anti inflammation and analgesia in mice of each group（±s，n = 10）

注：與空白組比較，#P ＜0.05；與模型組比較，*P ＜0.05。

扭體抑制率/%空白組 0.24 ± 0.09 100.00 ± 0.09 0.0 ± 0.00 100.00 ± 0.00模型組 98.13 ± 11.18# 0.0 ± 0.00# 40.25 ± 3.50# 0.0 ± 0.00#阿司匹林組 48.31 ± 2.49*# 50.77 ± 2.54*# 9.75 ± 2.99*# 75.78 ± 7.42*#S1 組 52.43 ± 3.31*# 46.57 ± 3.37*# 13.20 ± 3.19*# 67.20 ± 7.94*#S2 組 60.24 ± 3.94*# 38.61 ± 4.02*# 14.40 ± 2.88*# 64.22 ± 7.16*#S3 組 51.83 ± 3.98*# 47.18 ± 4.06*# 12.67 ± 3.21*# 68.53 ± 7.99*#S4 組 49.55 ± 4.01*# 49.51 ± 4.09*# 10.00 ± 2.58*# 75.16 ± 6.42*#S5 組 49.15 ± 7.02*# 49.92 ± 7.15*# 16.33 ± 2.94*# 59.42 ± 7.31*#S6 組 53.11 ± 3.86*# 45.88 ± 3.94*# 9.60 ± 3.05*# 76.15 ± 7.58*#S7 組 58.53 ± 7.34*# 40.36 ± 7.48*# 12.20 ± 2.59*# 69.69 ± 6.43*#S8 組 50.88 ± 5.29*# 48.15 ± 5.39*# 15.80 ± 2.39*# 60.75 ± 5.93*#S9 組 57.05 ± 3.18*# 41.87 ± 3.24*# 10.50 ± 2.65*# 73.91 ± 6.57*#S10 組 56.33 ± 2.92*# 42.60 ± 2.98*# 14.20 ± 2.39*# 64.72 ± 5.93*#S11 組 50.89 ± 3.93*# 48.14 ± 4.00*# 11.00 ± 2.58*# 75.16 ± 6.41*#F 58.101 58.101 40.005 40.005 P 0.000 0.000 0.000 0.000組別 耳腫脹度/% 腫脹抑制率/%15 min 內(nèi)扭體次數(shù)/次

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

精密度考察結(jié)果顯示各共有峰的相對保留時(shí)間RSD < 0.6%，共有峰峰面積RSD < 1.0%，色譜圖的相似度大于 0.99，表明設(shè)備精密度良好；穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示各共有峰相對保留時(shí)間RSD < 0.9%，共有峰面積RSD < 1.3%，色譜圖相似度大于 0.99，表明24 h 內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好；重復(fù)性考察結(jié)果顯示各共有峰相對保留時(shí)間RSD < 0.8%，共有峰面積RSD <1.2%，色譜圖相似度大于 0.99，表明方法重復(fù)性良好。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

取“1.5.4”項(xiàng)下供試品溶液，在“1.5.4”項(xiàng)下色譜條件下測定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)軟件（2012 版）”進(jìn)行共有峰的匹配，得到指紋圖譜，對各色譜峰進(jìn)行平滑、去噪、峰對齊后，生成對照指紋圖譜，見圖1，共標(biāo)記23 個(gè)共有峰。與對照圖譜比較，11 批樣品圖譜相似度在0. 653 ～0.975 之間，相似度結(jié)果見表3。

圖1 2 批對照藥材及11 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig. 1 The HPLC fingerprint of 2 batches of control herbs and 11 batches of samples

表3 2 批對照藥材及11 批樣品指紋圖譜相似度Tab. 3 The fingerprint similarity of 2 batches of control herbs and 11 batches of samples

2.4 譜效關(guān)系分析

考慮威靈仙各批次藥材相似度較低，為了更全面的反映化學(xué)成分與藥效之間的關(guān)系，因此在23 個(gè)共有峰的基礎(chǔ)上，又在對照圖譜上選擇峰面積占比大于0.5%的15 個(gè)特征峰進(jìn)行譜效關(guān)系分析，38 個(gè)特征峰保留時(shí)間見表4。以38 個(gè)特征峰的峰面積作為自變量（X），編號為X1、X2、X3…X38，各批次威靈仙腫脹抑制率或扭體抑制率作為因變量（Y），將數(shù)據(jù)分別代入MINITAB 17 軟件，建立偏最小二乘回歸方程，得到特征峰與腫脹抑制率或扭體抑制率之間的回歸方程，腫脹抑制率Y= - 0.033 8X1- 0.122 7X2+ 0.058 4X3- 0.050 9X4+ 0.059 7X5+ 0.065 3X6+ 0.051 4X7+0.093 4X8+ 0.032 5X9+ 0.023 8X10+ 0.015 9X11+ 0.013 4X12-0.060 8X13- 0.131 3X14+ 0.004 3X15- 0.169 4X16+0.023 6X17+ 0.072 2X18- 0.027 8X19- 0.211 5X20-0.073 0X21+ 0.320 3X22+ 0.027 7X23+ 0.038 0X24+0.008 8X25- 0.013 2X26+ 0.007 3X27- 0.090 3X28+0.1 480X29- 0.109 5X30+ 0.144 9X31+ 0.083 0X32-0.120 9X33- 0.080 5X34+ 0.025 1X35- 0.191 5X36+0.031 1X37- 0.000 5X38（R2= 0.959 5）；扭體抑制率Y= - 0.151 5X1- 0.119 8X2- 0.077 1X3- 0.183 9X4-0.082 8X5- 0.043 8X6+ 0.075 8X7+ 0.008 6X8- 0.009 0X9+0.057 0X10+ 0.073 9X11+ 0.030 5X12+ 0.143 7X13+ 0.067 0X14+0.007 4X15+ 0.101 9X16+ 0.136 6X17+ 0.022 8X18-0.045 5X19- 0.054 1X20+ 0.023 3X21- 0.136 4X22-0.037 1X23+ 0.013 4X24+ 0.005 8X25- 0.192 9X26+0.012 1X27- 0.051 1X28- 0.063 4X29- 0.116 5X30+0.083 0X31+ 0.146 7X32- 0.085 2X33- 0.023 0X34+0.090 7X35+ 0.226 3X36- 0.006 8X37+ 0.048 7X38（R2= 0.973 8）。其中，各項(xiàng)系數(shù)代表對應(yīng)特征峰對藥效的貢獻(xiàn)大小，絕對值越大對藥效貢獻(xiàn)越大，正值代表與藥效正相關(guān)，負(fù)值代表與藥效負(fù)相關(guān)，偏最小二乘回歸模型回歸系數(shù)見圖2。結(jié)果可見，與抗炎作用呈較大（相關(guān)系數(shù)絕對值≥01，下同）正相關(guān)的特征峰有3 個(gè)，為P22 ＞P29 ＞P31，呈較大負(fù)相關(guān)的特征峰有7 個(gè)，為P20 ＞P36 ＞P16 ＞P14 ＞P2 ＞P33 ＞P30；與鎮(zhèn)痛作用呈較大正相關(guān)的特征峰有5個(gè)，為P36 ＞P32 ＞P13 ＞P17 ＞P16，呈較大負(fù)相關(guān)的特征峰有6 個(gè)，為P26 ＞P4 ＞P1 ＞P22 ＞P2 ＞P30。

表4 特征峰保留時(shí)間Tab. 4 Retention time of characteristic peaks

3 討論

3.1 提取條件及色譜條件的選擇

由于2020 年版《中國藥典》中對威靈仙定量分析提取方法的要求較為繁瑣，相當(dāng)于是對齊墩果酸的富集，圖譜成分簡單，不可用于指紋圖譜分析。因此，本研究參考文獻(xiàn)[9-10]對比了不同濃度甲醇及不同濃度乙醇的提取效率，結(jié)果顯示100%甲醇提取液的HPLC 色譜峰相對較多，且峰高相對均衡，因此采用100%甲醇作為提取液。由于威靈仙中成分主要為皂苷類，故文獻(xiàn)中多選205 ～210 nm 作為檢測波長，本研究對威靈仙及棉團(tuán)鐵線蓮對照藥材供試品溶液進(jìn)行紫外全波長掃描，均在205 nm 處呈最大吸收，故選擇205 nm 作為檢測波長。針對流動相，本研究對比了乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈-水作為流動相各色譜峰略微拖尾，而以乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水作為流動相各色譜峰峰形較好，且無差別，故選擇乙腈-0.05%磷酸水作為流動相。

圖 2 特征峰標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)Fig. 2 Characteristic peak standardization coefficient

3.2 抗炎鎮(zhèn)痛作用譜效關(guān)系分析

結(jié)果顯示，有3 個(gè)特征峰與抗炎作用呈較大正相關(guān)，有7 個(gè)特征峰呈較大負(fù)相關(guān)，有5 個(gè)特征峰與鎮(zhèn)痛作用呈較大正相關(guān)，有6 個(gè)特征峰呈較大負(fù)相關(guān)。表明威靈仙中的化學(xué)成分對抗炎鎮(zhèn)痛作用既有正向調(diào)節(jié)作用也有負(fù)向調(diào)節(jié)作用?？傮w來看，不同基原威靈仙在抗炎與鎮(zhèn)痛藥效方面起效的物質(zhì)基礎(chǔ)之間存在較大差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在威靈仙飲片加工過程中，可針對不同用途，參考與抗炎或鎮(zhèn)痛作用具有較大正相關(guān)的成分作為評價(jià)指標(biāo)，采用不同方法及輔料對威靈仙進(jìn)行合理的炮制加工，以達(dá)到提高臨床治療效果的目的。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過偏最小二乘回歸法建立了不同來源威靈仙抗炎鎮(zhèn)痛的譜效關(guān)系，初步預(yù)測了抗炎鎮(zhèn)痛的物質(zhì)基礎(chǔ)，為威靈仙飲片的炮制加工及臨床合理用藥提供理論研究基礎(chǔ)。但本研究只是初步研究了不同基原威靈仙抗炎鎮(zhèn)痛的譜效關(guān)系，對于具體藥效物質(zhì)的定性、定量分析及作用機(jī)制研究尚需深入研究。