一種苯酚降解菌Pseudoxanthomonas sp. BF-6的分離鑒定及其降解特性及途徑研究

衛(wèi)曉博 侯穎 程豪杰 秦翠麗 牛明福 徐建強(qiáng)

（1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，洛陽 471023；2. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，洛陽471023；3.河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，洛陽 471023；4. 河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，洛陽 471023）

苯酚是染料、炸藥、造紙、聚合樹脂、煉油、煤氣、焦化、制藥及紡織等多種工業(yè)生產(chǎn)廢水中最主要的污染物［1］。苯酚屬于毒性很強(qiáng)的有機(jī)污染物，已被列入中國水環(huán)境優(yōu)先控制污染“黑名單”［2］。含酚廢水不經(jīng)處理而任意排放，不但污染生態(tài)環(huán)境，而且會對動、植物產(chǎn)生有毒甚至致命的危害，影響生物及人類生存與健康。

目前，國內(nèi)外處理含酚廢水的方法主要有物理法、化學(xué)法、生物法及各種結(jié)合法，其中生物處理法是一種經(jīng)濟(jì)有效且無二次污染的理想方法［3］。雖然酚類化合物是一種生物毒性物質(zhì)，但是很多微生物（包括好氧的和厭氧的）均可利用酚類化合物作為生長碳源，因此可以利用微生物處理含酚廢水［4］。國內(nèi)外學(xué)者針對苯酚微生物降解方面開展了大量的研究工作，分離鑒定的具有降解苯酚能力的微生物廣泛分布于細(xì)菌的假單胞菌屬（Pseudonomonas）［5-6］、芽 孢 桿 菌 屬（Bacillus）［7-8］、 不 動 桿 菌 屬（Acinetobacter）［9-10］、紅球菌屬（Rhodococcus）［11-12］，放線菌的諾卡氏菌屬（Nocardia）［13］和真菌的酵 母 菌 屬（Yeast）［14-15］及 煙 曲 霉（Aspergillus fumigatus）［16］等。無論是細(xì)菌還是真菌其好氧降解苯酚的途徑都是苯酚先在苯酚羥化酶的作用下轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，然后鄰苯二酚在鄰位開環(huán)酶（鄰苯二酚1，2-雙加氧酶）或間位開環(huán)酶（鄰苯二酚2，3-雙加氧酶）作用下打開苯環(huán)［17］。

本研究從河南某農(nóng)藥廠廢水處理系統(tǒng)中獲得一株能夠以苯酚為唯一碳源生長的苯酚降解菌株BF-6，采用16S rRNA序列分析和生理生化試驗對該菌株分類學(xué)地位進(jìn)行了初步鑒定，并對該菌株降解苯酚的特性和途徑進(jìn)行了研究，以期為含苯酚廢水的生物處理提供新的菌株資源和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 河南某農(nóng)藥廠污水處理系統(tǒng)活性污泥。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉20.0。無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM，g/L）：NH4NO31.0，KH2PO40.5，K2HPO41.5，NaCl 1.0，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0。苯酚、鄰苯二酚、4-氨基安替比林、鐵氰化鉀、氨水等均為分析純，購自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。黃素腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽（FAD-Na2）、還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽（NADH-Na2）、還原型β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2-磷酸四鈉鹽（NADPH-Na4）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 苯酚降解菌的馴化、分離和純化 取5 g污泥樣品，加到含50 mg/L苯酚濃度的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，并添加終濃度為20 mg/L的酵母汁后，在30℃、180 r/min的搖床上進(jìn)行富集培養(yǎng)7 d，富集液經(jīng)測定苯酚降解率達(dá)到90%以上后，取其上清液5 mL加入到含100 mg/L苯酚的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min繼續(xù)富集，并以100 mg/L的梯度逐步提高苯酚濃度最高至1 000 mg/L。取最后一輪富集液配制成10-1、10-2、10-3.....10-6梯度的稀釋液，然后取10-4、10-5、10-6稀釋液各0.2 mL涂布在苯酚無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察平板上菌落的生長情況，挑選其中清晰可見的單菌落，利用LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行多次分離純化，并對這些菌株進(jìn)行編號。將純化好的菌株經(jīng)LB液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后，按5%接種量接種到含100 mg/L苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行苯酚降解試驗，48 h后取樣測定苯酚含量的變化，取降解效果最佳的菌株進(jìn)行鑒定，并研究不同環(huán)境因素對苯酚降解的影響及其降解苯酚的途徑。

1.2.2 苯酚降解菌的鑒定 根據(jù)16S rRNA基因序列分析并結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征等對篩選到的苯酚降解菌進(jìn)行鑒定。首先在LB固體培養(yǎng)基上對菌株進(jìn)行平板劃線，于30℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)特征；挑取少量菌體進(jìn)行簡單染色后利用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)；并參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［18］對菌株進(jìn)行生理生化特征分析。

將菌株經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，取3 mL菌液，利用細(xì)菌基因組提取試劑盒（AxyPrep）提取菌株的總DNA，以此為模板，利用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′） 進(jìn) 行PCR擴(kuò) 增。PCR體 系（50 μL） 為 ：2×taq master mix 25 μL， 引 物 27F（25 pmol/μL） 和 1492R（25 pmol/μL）各 2 μL，細(xì)菌基因組 DNA（約 50 ng/μL）1 μL，滅菌雙蒸水 20 μL。PCR 程序為 ：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；最后72℃終延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.75%瓊脂糖凝膠電泳驗證后送上海生工生物公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果通過BLAST與NCBI數(shù)據(jù)庫基因序列進(jìn)行比對，并通過MEGA-X軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 降解菌株種子液的制備 從LB 平板上挑取苯酚降解菌株單菌落，接種于3 mL LB液體培養(yǎng)基中于30℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，然后將培養(yǎng)液接到100 mL新的液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，6 000 r/min離心10 min收集菌體，用滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌菌體沉淀3次后，制成OD600=1.5的菌液，即種子液。

1.2.4 環(huán)境因素對菌株降解苯酚的影響 以菌液初始濃度 OD600=1.5，5%接種量、苯酚初始濃度100 mg/L、pH 值8.0、溫度37℃、轉(zhuǎn)速180 r/min為初始培養(yǎng)條件，采用單變量法研究溫度、pH值、苯酚濃度、接種量和金屬離子對菌株降解苯酚能力的影響。

1.2.5 菌株生物量測定 采用分光光度法在600nm波長處測定細(xì)胞懸浮液的吸光度，以O(shè)D600數(shù)值表示其生物量。

1.2.6 苯酚含量的測定 采用4-氨基安替比林分光光度法測苯酚含量［19］。方法如下：配制苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確稱取0.100 g苯酚，配置成100 mg/L的苯酚溶液。分別移取1、2、4、6、8和10 mL苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液置于50 mL比色管中，稀釋定容至刻度。在6支比色管中分別加入0.5 mL氨水-氯化銨緩沖液，混勻，然后加入1.0 mL的2% 4-氨基安替比林溶液，再加入1.0 mL的8%鐵氰化鉀溶液，充分混勻，放置10 min后，立即于510 nm波長處，以水為參比，測定其吸光度，并繪制吸光度對苯酚含量（mg）的校準(zhǔn)曲線。將不同時間的培養(yǎng)液經(jīng)6 000 r/min離心10 min去除菌體細(xì)胞后，取適量體積上清液，用與繪制校準(zhǔn)曲線相同步驟測定吸光度，并對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算苯酚含量。

1.2.7 菌株BF-6降解苯酚途徑 通過檢測菌株細(xì)胞內(nèi)苯酚羥化酶活性和鄰苯二酚雙加氧酶的活性，可以推測菌株降解苯酚的途徑。將菌株BF-6接種于含200 mg/L苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2 d，6 000 r/min離心收集菌體，菌體沉淀經(jīng)200 W超聲波破碎20 min后，12 000 r/min離心20 min，取其上清液即為菌株BF-6細(xì)胞粗酶液。在粗酶液中分別添加10 mmol/L苯酚，1 mmol/L FAD和100 mmol/L NADPH或100 mmol/L NADH，然后利用紫外可見分光光度計在340nm處檢測粗酶液中NADPH或NADH吸光度的變化，以確定粗酶液是否具有苯酚羥化酶活性［20］。在粗酶液中分別添加1 mmol/L的FeSO4和10 mmol/L或100 mmol/L鄰苯二酚，利用紫外可見分光光度計檢測粗酶液中260 nm和375 nm吸光度的變化，以確定粗酶液是否具有鄰苯二酚雙加氧酶活性［17］。苯酚羥化酶一個酶活力單位定義為每分鐘氧化 l μmol NADPH所需的酶量，鄰苯二酚雙加氧酶一個酶活力單位定義為產(chǎn)生 l μmol順，順-黏糠酸或2-羥基黏糠酸半醛所需的酶量。

2 結(jié)果

2.1 苯酚降解菌的分離鑒定

經(jīng)過連續(xù)富集，從農(nóng)藥廠活性污泥樣品中分離得篩選到一株可以苯酚為唯一碳源的高效降解菌株，命名為BF-6。經(jīng)過LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，BF-6在LB平板上形成較大的菌落，菌落中間突起，圓形，邊緣整齊菌體顏色為乳白色，表面黏稠濕潤（圖1-A）。菌株BF-6在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)為桿狀，無莢膜，無芽孢（圖1-B）。

菌株BF-6部分生理生化試驗結(jié)果如表1所示，在7種供試碳源中，菌株BF-6可以利用葡萄糖、蔗糖、乳糖和乙醇，不能利用木糖、甘露醇和甲醇；7種供試氮源菌株BF-6都能利用。菌株BF-6對阿奇霉素、四環(huán)素、卡那霉素和諾氟沙星4種抗生素沒有抗性，但對青霉素、鏈霉素、頭孢克肟、呋喃唑酮等9種供試抗生素均有抗性。菌株BF-6的革蘭氏染色反應(yīng)、甲基紅試驗、V-P試驗、淀粉水解酶試驗、反硝化試驗、明膠液化試驗等試驗結(jié)果均為陰性，過氧化氫酶試驗陽性，其最適生長溫度為37℃，最適生長pH值為8.0。

表1 菌株BF-6部分生理生化試驗結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical test of strain BF-6

對菌株BF-6的16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了大小約1 500 bp的目的片段，經(jīng)測序獲得長為1 513 bp的有效片段，序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為MW165868。將序列在NCBI上利用BLAST進(jìn)行序列相似性比對，BF-6菌株與Pseudoxanthomonasmexicana（AB246798）的16S rRNA基因序列相似性為99.8%。選取Ribosomal Database Project 中假黃單胞菌屬部分菌株的16S rRNA基因序列與BF-6菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建，同時選取寡養(yǎng)單胞菌屬部分菌株Stenotrophomonas bentonitica BII-R7（HG800055）、Stenotrophomonas maltophilia IAM 12423（AB294553）、Stenotrophomonas pavanii ICB 89（FJ748683）作為外群，結(jié)果見圖2。菌株BF-6的16S rRNA基因序列與Pseudoxanthomonas indica相應(yīng)序列最近，聚為一支。結(jié)合菌株BF-6的形態(tài)特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株BF-6鑒定為Pseudoxanthomonas sp.。

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株BF-6系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by the neighbor-joining analysis based on 16S rRNA gene sequences of strain BF-6 and related species

2.2 環(huán)境因素對菌株BF-6降解苯酚的影響

2.2.1 菌株BF-6以苯酚為唯一碳源的生長曲線及苯酚降解曲線 按5%接種量將菌株BF-6接種到100 mg/L苯酚為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中、pH 值8.0、溫度37℃、轉(zhuǎn)速180 r/min震蕩培養(yǎng)。每6 h進(jìn)行取樣一次，首先采用分光光度法在600 nm處測定菌株BF-6生長情況，然后將培養(yǎng)液進(jìn)行離心，取上清液測定苯酚含量，以時間為橫坐標(biāo)，以菌株的生長量OD600和苯酚含量為縱坐標(biāo)繪制菌株BF-6以苯酚為唯一碳源的生長曲線及苯酚降解曲線，結(jié)果如圖3所示。在0-24 h時菌株BF-6生長緩慢，甚至在18-24 h時出現(xiàn)生長量下降，但在24-36 h時則開始呈指數(shù)增長，說明菌株BF-6在含有苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中需要經(jīng)過較長時間的延滯期，然后才能進(jìn)入對數(shù)生長期；培養(yǎng)基中苯酚含量在0-30 h時呈緩慢下降，30-36 h時則迅速下降，結(jié)合生長曲線的變化情況，可知苯酚的迅速降解與菌株的對數(shù)生長相一致，36 h時苯酚降解率為97.79%；36 h后隨著苯酚含量的減少，菌株BF-6的生長量又開始降低，到48 h時苯酚降解率達(dá)到98.51%。

圖3 菌株BF-6以苯酚為唯一碳源的生長曲線及苯酚降解曲線Fig.3 Growth curve of strain BF-6 and degradation curve of phenol by using phenol as sole carbon source

2.2.2 溫度對菌株BF-6降解苯酚的影響 溫度是影響微生物菌株降解能力的主要環(huán)境因素之一，因為溫度的變化對微生物細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)有著顯著的影響。為了研究溫度對菌株BF-6降解苯酚能力的影響，分別在中溫微生物常用最適培養(yǎng)溫度20、25、30、37和42℃條件下進(jìn)行苯酚降解試驗，并定時監(jiān)測苯酚的殘留量。由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度在20-37℃之間時，菌株BF-6均可高效的降解苯酚，其在48 h內(nèi)對100 mg/L苯酚的降解率分別為95.7%、96.9%、97.7%和97.9%；但當(dāng)溫度為42℃時，菌株BF-6對苯酚的降解率僅為3.3%，說明其降解苯酚的能力受到了顯著的抑制。由于菌株BF-6在20-37℃條件下對苯酚都有較高的降解率，表明菌株BF-6對一般環(huán)境溫度有很強(qiáng)的適應(yīng)性。

圖4 溫度對菌株BF-6降解苯酚的影響Fig.4 Effect of temperature on degradation of phenol by strain BF-6

2.2.3 pH對菌株BF-6降解苯酚的影響 培養(yǎng)液酸堿度的變化會對微生物酶的合成和催化活性產(chǎn)生很大的影響，進(jìn)而影響微生物的生長發(fā)育及其對污染物的降解能力。對菌株BF-6在不同pH值條件下降解苯酚的能力進(jìn)行了研究，由圖5可以得出，在pH值5.0-10.0范圍內(nèi)，菌株BF-6均能夠表現(xiàn)出良好的苯酚降解能力，當(dāng)pH值為8.0時，菌株BF-6在48 h內(nèi)對100 mg/L的苯酚的降解率達(dá)到最大，為97.41%，即使在pH為5.0和10.0時苯酚的降解率也可達(dá)到80%以上；從以上數(shù)據(jù)可以看出，菌株BF-6可以很好適應(yīng)大多數(shù)自然環(huán)境中的酸堿度而發(fā)揮很強(qiáng)的降解作用。

圖5 pH對菌株BF-6降解苯酚的影響Fig.5 Effect of pH on the degradation of phenol by strain BF-6

2.2.4 苯酚濃度對菌株BF-6降解苯酚的影響 由于中低濃度（＜1 000 mg/L）含酚廢水中的苯酚已無回收價值，所以廣泛采用生物法處理。對菌株BF-6在不同濃度苯酚條件下的降解能力進(jìn)行了研究，即按5%接種量將菌株BF-6接種到不同初始濃度苯酚的培養(yǎng)基中，并定時采樣，測定培養(yǎng)基中苯酚的含量變化。由圖6可以看出，當(dāng)苯酚初始濃度為100和200 mg/L時，菌株BF-6能夠在2 d和4 d內(nèi)將其降解；而當(dāng)苯酚初始濃度上升至500 mg/L時，菌株BF-6降解苯酚的能力受到明顯的抑制，直到10 d時才能被完全降解。當(dāng)苯酚初始濃度為700 mg/L和1 000 mg/L時，菌株BF-6降解苯酚的能力基本完全受到抑制，到10 d時，苯酚降解率僅為17.63%和14.88%。這可能是由于高濃度苯酚抑制了菌株BF-6的生長，從而導(dǎo)致其無法降解苯酚。

圖6 苯酚濃度對菌株BF-6降解苯酚的影響Fig.6 Effect of initial concentration on the degradation of phenol by strain BF-6

2.2.5 接種量對菌株BF-6降解苯酚的影響 接種量也是影響菌株降解污染物能力的重要因素之一，將菌株BF-6分別按1%、3%、5%、7%和10%的接種量接種于含100 mg/L苯酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，定時取樣測定苯酚含量，研究接種量對菌株BF-6降解苯酚的影響。由圖7可以看出，當(dāng)接種量為10%時，僅1 d的時間，菌株BF-6就能將100 mg/L的苯酚降解90.81%；當(dāng)接種量為5%和7%時，100 mg/L的苯酚需要2 d可以降解98%以上；當(dāng)接種量為1%和3%時，菌株BF-6也可以在3 d內(nèi)將苯酚降解90%以上，該結(jié)果表明接種量對菌株BF-6降解苯酚有很大影響。

圖7 接種量對菌株BF-6降解苯酚的影響Fig.7 Effect of inoculum quantity on the degradation of phenol by strain BF-6

2.2.6 金屬離子對菌株BF-6降解苯酚的影響 微生物是利用其產(chǎn)生的酶催化污染物進(jìn)行降解的，很多金屬離子是酶的激活劑，但也有很多金屬離子往往會破壞酶的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)而使酶失去活性。因此，我們對常見金屬離子對菌株BF-6降解苯酚能力的影響進(jìn)行了研究。由圖8可以看出，與接種菌株BF-6而不額外添加金屬離子的對照相比，除0.5 mmol/L的Fe3+、Ca2+和Cr3+對菌株BF-6降解苯酚沒有影響之外，其他金屬離子均對菌株BF-6降解苯酚產(chǎn)生了很強(qiáng)的抑制作用。

圖8 金屬離子對菌株BF-6降解苯酚的影響Fig.8 Effect of metal ions on the degradation of phenol by strain BF-6

2.3 菌株BF-6降解苯酚途徑

微生物對污染物的降解都是通過其分泌的酶進(jìn)行催化的，研究表明參與苯酚好氧降解的關(guān)鍵酶有苯酚羥化酶和鄰苯二酚雙加氧酶。將菌株BF-6用苯酚進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)后，利用紫外分光光度計檢測其胞內(nèi)酶液的苯酚羥化酶和鄰苯二酚雙加氧酶活性（圖9）。由圖9-A可以看出，在苯酚羥化酶活性測定過程中，當(dāng)以NADPH為輔酶時，在反應(yīng)的30 min內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的延長，340 nm的吸光值逐漸降低，即NADPH逐漸減少，表明粗酶液中含有苯酚羥化酶活性，該酶催化苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，所以消耗了NADPH，經(jīng)計算該粗酶液中苯酚羥化酶活力約為0.71 U/mg。由圖9-B可以看出，在鄰苯二酚雙加氧酶活性測定的10 min內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的延長，260 nm處的吸光值明顯增加，但在375 nm處未檢測到吸光值的變化，該結(jié)果表明菌株BF-6的粗酶液含有鄰苯二酚1，2-雙加氧酶活性，但不含有鄰苯二酚2，3-雙加氧酶活性，經(jīng)計算該粗酶液中鄰苯二酚1，2-雙加氧酶活力約為13.39 U/mg。上述酶活測定結(jié)果表明菌株BF-6對苯酚的降解首先是通過苯酚羥化酶催化苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，然后鄰苯二酚在鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的催化下轉(zhuǎn)化為順，順-黏糠酸，即菌株BF-6是通過鄰位途徑實現(xiàn)苯酚降解的。

圖9 苯酚羥化酶（A）和鄰苯二酚雙加氧酶（B）活性測定Fig.9 Determination of phenol hydroxylase（A）and catechol dioxygenase（B）

3 討論

苯酚是最常見的工業(yè)有機(jī)污染物，利用微生物降解苯酚是解決苯酚環(huán)境污染問題最理想的一種方式。自然環(huán)境中很多微生物能夠降解苯酚，特別是在含有苯酚的工業(yè)廢水處理系統(tǒng)中，往往可以分離到能夠高效降解苯酚的微生物菌株。本研究從農(nóng)藥廠廢水處理系統(tǒng)中分離到了能夠降解苯酚的菌株BF-6，通過形態(tài)特征、生理生化試驗和16S rRNA基因序列分析將其鑒定為假黃單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）。關(guān)于微生物降解苯酚的報道雖然已有很多，但關(guān)于假黃單胞菌降解苯酚的研究還未見報道。菌株BF-6在溫度為20-37℃和pH值為5-10的環(huán)境條件下均可實現(xiàn)對苯酚的高效降解，其在37℃、pH8.0和5%接種條件下，36 h內(nèi)可將100 mg/L苯酚降解97.79%。雖然該菌株對苯酚的降解能力低于已報道的其他菌株［5，9-10］，但本研究對于豐富苯酚微生物降解資源亦具有重要意義。

目前苯酚微生物降解的代謝途徑研究已較為透徹，特別是有氧代謝途徑普遍認(rèn)為是微生物首先通過苯酚羥化酶使苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，然后鄰苯二酚在鄰苯二酚雙加氧酶作用下打開苯環(huán)，并進(jìn)一步通過TCA循環(huán)使其轉(zhuǎn)化為微生物的細(xì)胞物質(zhì)［21］。苯酚羥化酶是一種單加氧酶，含有一個FAD結(jié)合域，且需要以NADH或NADPH為輔酶才能表現(xiàn)出催化活性，所以通過測定酶活反應(yīng)體系中NADH或NADPH含量變化即可檢測酶液是否具有苯酚羥化酶活性［20］。本研究在添加有FAD和NADPH的菌株BF-6酶活反應(yīng)體系中，通過紫外分光光度計檢測到了NADPH在340 nm處吸收峰隨著反應(yīng)時間的延長不斷降低，說明菌株BF-6粗酶液具有苯酚羥化酶活性，即證明菌株BF-6降解苯酚的第一步是通過苯酚羥化酶催化苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚實現(xiàn)的。苯酚在轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚后，可通過兩種途徑開環(huán)，即鄰位途徑，由鄰苯二酚1，2-雙加氧酶催化鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為順，順-黏糠酸，該產(chǎn)物在260 nm有特異性吸收峰以及間位途徑，由鄰苯二酚2，3-雙加氧酶催化鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為2-羥基黏糠酸半醛，該產(chǎn)物在375 nm處有特異性吸收峰［22］。通過測定以鄰苯二酚為底物的酶活反應(yīng)體系中特異吸收峰的變化情況，可判斷粗酶液具有哪種鄰苯二酚雙加氧酶，從而確定菌株是通過哪種途徑使鄰苯二酚開環(huán)［17］。本研究通過測定以鄰苯二酚為底物的菌株BF-6粗酶反應(yīng)體系特征性吸收峰的變化發(fā)現(xiàn)，菌株BF-6是通過鄰位途徑使鄰苯二酚開環(huán)的。綜上所述，菌株BF-6降解苯酚的途徑為好氧途徑，即其首先通過苯酚羥化酶催化苯酚轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，然后鄰苯二酚再在鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的催化下開環(huán)，進(jìn)而進(jìn)入TCA循環(huán)徹底降解，且使菌株以后續(xù)產(chǎn)物為碳源進(jìn)行生長。本結(jié)果與金屬離子對菌株BF-6降解苯酚的影響中Fe3+對菌株降解苯酚能力沒有產(chǎn)生抑制作用相印證，因為大量研究表明鄰苯二酚1，2-雙加氧酶需要Fe3+作為活性中心［23］。

4 結(jié)論

從農(nóng)藥廠廢水處理系統(tǒng)中獲得了一株可以降解苯酚的菌株BF-6，經(jīng)16S rRNA序列分析和生理生化試驗鑒定其為假黃單胞菌（Pseudoxanthomonas sp.）。菌株BF-6能夠以苯酚為唯一碳源進(jìn)行生長，其在20-37℃和pH值5.0-10.0條件下都可以很好地降解100 mg/L的苯酚，5%接種量條件下36 h內(nèi)降解率可以達(dá)到97.79%。Fe3+、Ca2+和Cr3+對菌株BF-6降解苯酚沒有影響，而Fe2+、Mn2+、Co2+、Ni2+和Cu2+均對菌株BF-6降解苯酚產(chǎn)生了明顯的抑制作用。經(jīng)苯酚誘導(dǎo)的菌株BF-6粗酶液具有苯酚羥化酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶活性，說明菌株BF-6降解苯酚的途徑為好氧鄰位途徑。