張偉錚 阿依姑再·艾力 鄧光遠 李松 張軒 黃彬 蔡依玫

1廣州市干部健康管理中心廣州市第十一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科 510530；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 510006；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院廣東省中醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部510006；4中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部，廣州 510075

腸桿菌目細菌（Enterobacterales）是一種無芽孢、周身鞭毛或無鞭毛的革蘭陰性桿菌，通?？梢鹉c道、泌尿道、膽道、腹腔及血流感染（菌血癥和敗血癥）［1］。碳青霉烯類藥物是治療多重耐藥菌感染的首選藥物。近幾十年來，隨著臨床抗菌藥物的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌（carbapenem-resistantEnterobacterales，CRE）的數(shù)量明顯增多，現(xiàn)如今已成為院內(nèi)感染的高危病原菌［2］。CRE 因耐藥性強和致死率高，被稱為“超級細菌”。CRE 的耐藥機制主要是細菌自身產(chǎn)生的碳青霉烯酶［3-6］，其次是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）和/或AmpC 酶過度表達合并膜孔蛋白缺失、外排泵過表達和藥物靶位改變［7］。碳青霉烯酶按Ambler 分子分類為A、B、D 3 類酶。A類為絲氨酸酶，KPC 是最具臨床意義的A 類酶；B 類為金屬β-內(nèi)酰胺酶，是研究最多的碳青霉烯酶，主要包括NDM、IMP和VIM；D類也屬于絲氨酸酶，主要是OXA-48。碳青霉烯酶的臨床檢測方法包括聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、改良Hodge 試驗、Carba NP 試驗、改良碳青霉烯滅活試驗（modified carbapenem in activation method，mCIM）、EDTA 碳青霉烯滅活試驗（EDTA-modified carbapenem in activation method，eCIM）和免疫層析法等［8］。mCIM 聯(lián)合eCIM 可以區(qū)分碳青霉烯酶是產(chǎn)A 類絲氨酸酶或產(chǎn)B 類金屬β-內(nèi)酰胺酶，相對于Carba NP 和MHT，它操作簡便、價格低廉且已獲得美國臨床實驗室標準化協(xié)會（clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）認可［9］。其主要缺點是孵育時間長，總耗時長。商品化免疫膠體金試劑盒是通過碳青霉烯酶抗原與膠體金標記的抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，通過層析作用而顯色的一種試劑盒。現(xiàn)如今國外已有NG-Test CARBA 5試劑盒［10］。該試劑盒可以直接檢測5 類常見的碳青霉烯酶（KPC、NDM、IMP、VIM 和OXA-48），操作簡便快速，可是成本較高。本實驗使用的商品化免疫膠體金試劑盒檢測單個類型的碳青霉烯酶試劑盒，相較于NG-Test CARBA 5，該試劑盒可依據(jù)菌種特征，優(yōu)先選擇不同的碳青霉烯酶單獨測試，相對成本較低，利于常見表型（如KPC 和NDM 酶）的檢出，指導(dǎo)臨床合理用藥。本研究通過對免疫膠體金試劑盒的性能評價，評估其能否廣泛應(yīng)用于臨床碳青霉烯酶的檢測。

1 實驗材料

1.1 菌株 收集廣東省2 家三甲醫(yī)院2016 年1 月至2020 年 12 月臨床分離的 88 株 CRE（廣東省中醫(yī)院 64 株，中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院24 株），剔除來自同一患者的重復(fù)株。所有菌株經(jīng)全自動微生物分析儀Vitek 2 鑒定和藥敏測試。根據(jù)CLSI M100-S31 指南，CRE 對厄他培南、亞胺培南或美羅培南任一藥物耐藥。質(zhì)控菌株選用大腸埃希菌ATCC 25922。所有菌株用25% 甘油-LB 肉湯保種，-80 ℃凍存，實驗前用血平板復(fù)蘇備用。

1.2 試劑 血平板、MH 平板（廣州迪景微生物科技有限公司），PCR 擴增試劑、DNA Marker DL 2000（日本TakaRa公司），PCR 引物、乙二胺四乙酸（EDTA）、NaOH 結(jié)晶（生工生物工程上海股份有限公司），Glodview 熒光染料（廣州東盛/民賽生物科技有限公司），免疫膠體金試劑盒（北京金山川科技發(fā)展有限公司），美羅培南藥敏紙片10 μg/ml、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（英國Oxoid公司）。

1.3 儀器 Veriti PCR 擴增儀（美國ABI 公司），DIYY-6C 型水平電泳儀（北京六一儀器廠），Vilber Lourmat凝膠成像系統(tǒng)（法國Vilber Lourmat公司）。

2 實驗方法

2.1 菌株的復(fù)蘇 用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液，分區(qū)劃線接種于血平板，35 ℃培養(yǎng)16～18 h，觀察菌落生長情況，挑單克隆接種于含100 μg/ml 氨芐西林的LB 平板，30 ℃培養(yǎng)16～18 h。

2.2 碳青霉烯酶基因檢測

2.2.1 細菌DNA的提取 將新鮮細菌懸浮于100μl滅菌雙蒸水中，充分混勻，100 ℃煮沸10 min；12 000 r/min 離心5 min（離心半徑15 cm），將上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌EP管，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 PCR 擴增 ⑴PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 40 s，退火 50 s，72 ℃延伸 50 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 檢測碳青霉烯酶基因的引物序列和擴增片段長度見表1。⑵電泳：將擴增產(chǎn)物加入至1%瓊脂糖凝膠孔中，在150 V電壓下電泳25 min后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，以DNA Marker2000 作為分子量標準，出現(xiàn)與陽性對照分子量相同的條帶判為陽性。陽性PCR擴增產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)有限公司測序驗證，并進行Blast 同源序列比對分析。

表1 碳青霉烯酶基因所用引物序列及擴增片段長度和退溫溫度

2.3 mCIM 聯(lián)合 eCIM 采用 mCIM 聯(lián)合 eCIM 檢測88 株CRE 是否產(chǎn)碳青霉烯酶。mCIM 聯(lián)合eCIM 參照第31版M100《抗菌藥物敏感性試驗性能標準》［11］。

2.3.1 mCIM 稱取30 g TSB 干粉溶于1 L 去離子水，121 ℃高壓滅菌15 min 備用。挑取1μl 接種環(huán)的新鮮菌落充分溶于2 ml TSB 肉湯，放入1 張含10μg 美羅培南藥敏紙片，37 ℃孵育4 h。取出紙片并盡量擠去多余水分，貼于已均勻涂布0.5 MCF 大腸埃希菌ATCC 25922 的MH 瓊脂平板，37 ℃5%CO2培養(yǎng)18～24 h后測量抑菌圈直徑。結(jié)果判讀：美羅培南抑菌圈直徑6～15 mm 或16～18 mm 且抑菌圈中有菌落生長判定為產(chǎn)碳青霉烯酶；抑菌圈直徑≥19 mm 判定為不產(chǎn)碳青霉烯酶；抑菌圈直徑16～18 mm 或≥19 mm 且抑菌圈中有菌落生長，則無法判定是否產(chǎn)碳青霉烯酶。

2.3.2 eCIM 取1 μl 接種環(huán)的新鮮菌落充分溶于含20 μl PH8 0.5 M EDTA 的 2 ml TSB 肉湯，放入 1 張含 10 μg美羅培南藥敏紙片，37 ℃孵育4 h。隨后將兩實驗的MEM紙片貼在同一塊均勻涂布0.5 MCF大腸埃希菌ATCC 25922的MH 瓊脂平板，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng) 18～24 h 后測量抑菌圈直徑。結(jié)果判讀：當(dāng)mCIM 結(jié)果為陽性時，若eCIM 試驗紙片與mCIM 試驗紙片的抑制圈直徑≥5 mm，則判為產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶陽性菌；若兩者的抑菌圈直徑差≤4 mm，則判為產(chǎn)絲氨酸酶。

2.4 免疫膠體金試劑盒 根據(jù)基因型結(jié)果，應(yīng)用4 種商品化免疫顯色試劑盒檢測碳青霉烯酶。30 株攜帶blaKPC、24 株攜帶blaNDM、9 株攜帶blaIMP-4和 5 株攜帶blaVIM的 CRE 分別用 KPC、NDM、IMP-4 和 VIM 酶試劑盒進行檢測；20 株P(guān)CR 陰性的CRE 作為對照組，同時用4 種酶試劑盒進行檢測。 由于未檢出攜帶blaOXA-48的 CRE，本實驗未對OXA-48酶試劑盒進行檢測。

免疫膠體金試劑盒操作步驟如下：向無菌EP 管中滴入10滴樣本處理液，用一次性接種環(huán)蘸取過夜培養(yǎng)細菌菌落，插入滴有樣本處理液的無菌EP 管中，充分攪拌使其與溶液混勻，取50μl 處理后的樣本加至膠體金檢測盒的加樣孔，10 min 后讀取結(jié)果。在檢測卡的檢測區(qū)域中出現(xiàn)2 條紅色條帶，即結(jié)果為陽性。

3 結(jié) 果

3.1 PCR 檢測碳青霉烯酶基因 88 株 CRE 中，共檢出6 種常見的腸桿菌目細菌，包括43 株肺炎克雷伯菌（48.9%），20 株大腸埃希菌（22.7%），18 株陰溝腸桿菌（20.5%），3 株產(chǎn)氣克雷伯菌（3.4%），3 株弗氏檸檬酸桿菌（3.4%）和1 株粘質(zhì)沙雷菌（1.1%）。88 株CRE 中，68 株碳青霉烯酶基因陽性，包括30 株攜帶blaKPC，24 株攜帶blaNDM，9 株攜帶blaIMP-4以及 5 株攜帶blaVIM，未檢出blaOXA-48基因，見表2。5種碳青霉烯酶基因電泳結(jié)果見圖1。

圖1 5種碳青霉烯酶基因聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物電泳結(jié)果。A、B、C、D、E分別為blaKPC、blaNDM、blaIMP-4、blaVIM、blaOXA-48陽性菌電泳結(jié)果

表2 88株碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌的菌種鑒定和碳青霉烯酶基因分布（株）

3.2 mCIM 聯(lián)合 eCIM 檢測碳青霉烯酶 88 株 CRE 中，mCIM 陽性 66 株，2 株分別攜帶blaNDM和blaIMP-4的陰溝腸桿菌為假陰性。采用微量肉湯稀釋法驗證這2 株菌的耐藥表型，2 株菌對IPM 的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentrations，MICs）均為8 μg/ml，對美羅培南的MICs 分別為 8 μg/ml 和 4 μg/ml。20 株 CRE 中，mCIM 陰性，推測這20 株不產(chǎn)碳青霉烯酶CRE 的耐藥機制與ESBL/AmpC 酶合并膜孔蛋白缺失以及外排泵過表達相關(guān)。mCIM 靈敏度和特異度分別為97.1%（66/68）和100.0%（20/20）。mCIM 聯(lián)合eCIM 檢出36株產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶和30株產(chǎn)絲氨酸酶。這36 株產(chǎn)金屬 β-內(nèi)酰胺酶的 CRE 中，23 株攜帶blaNDM，8 株攜帶blaIMP-4，5株攜帶blaVIM。mCIM聯(lián)合eCIM能準確鑒定金屬β-內(nèi)酰胺酶，結(jié)果見表3。部分菌株mCIM 聯(lián)合eCIM 結(jié)果見圖2。

圖2 部分碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌mCIM 聯(lián)合eCIM 結(jié)果。A、B、C 分別為產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶、產(chǎn)絲氨酸酶和不產(chǎn)碳青霉烯酶菌株mCIM聯(lián)合eCIM結(jié)果

表3 88株碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌mCIM聯(lián)合eCIM與聚合酶鏈式反應(yīng)結(jié)果比較

3.3 免疫膠體金試劑盒檢測碳青霉烯酶 免疫膠體金試劑盒檢測68 株產(chǎn)碳青霉烯酶和20 株不產(chǎn)碳青霉烯酶的CRE。以PCR 為金標準，免疫膠體金試劑盒的總體靈敏度和特異度分別為98.5%（67/68）和100.0%（20/20），陽性預(yù)測值為100.0%（67/67），陰性預(yù)測值為95.2%（20/21），總符合率為98.9%（87/88）。KPC 酶試劑盒的靈敏度和特異度為100.0%（30/30）和100.0%（20/20）；NDM 酶試劑盒的靈敏度和特異度為100.0%（24/24）和100.0%（20/20）；IMP-4酶試劑盒的靈敏度和特異度為88.9%（8/9）和100.0%（20/20）；VIM酶試劑盒的靈敏度和特異度為100.0%（5/5）和100.0%（20/20）。1 株攜帶blaIMP-4的陰溝腸桿菌為假陰性，該菌mCIM 初篩試驗也為假陰性，經(jīng)耐藥表型復(fù)核，推測與IMP-4酶低表達量有關(guān)。然而，增加菌液濃度進行進一步實驗，結(jié)果仍為陰性。免疫膠體金試劑盒與PCR 結(jié)果對比見表4，部分菌株免疫膠體金試劑盒見圖3。Fisher 精確檢驗顯示，免疫膠體金試劑盒和mCIM 聯(lián)合eCIM 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

圖3 部分碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌免疫膠體金試劑盒檢測結(jié)果。A、B、C、D 分別為KPC、NDM、IMP-4、VIM 酶膠體金試劑盒檢測結(jié)果

表4 88株碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌免疫膠體金試劑盒與聚合酶鏈式反應(yīng)結(jié)果比較

3 討 論

隨著臨床抗菌藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯腸桿菌的檢出數(shù)量日益增多［12］，現(xiàn)如今已成為院內(nèi)感染的重要病原菌，而臨床對于這類細菌的感染治療可選擇藥物非常有限，并且不同基因型的治療方案也不同。例如，產(chǎn)KPC 的肺炎克雷伯菌對頭孢他啶/阿維巴坦的敏感性較好，相反，產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌和陰溝腸桿菌對其敏感性較差［13］。因此，對碳青霉烯酶基因型的鑒定可以早期有效地指導(dǎo)臨床合理用藥。

本研究收集了2 家三甲醫(yī)院臨床分離的88 株CRE，包括6 種常見腸桿菌（肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、大腸埃希菌、弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯菌和粘質(zhì)沙雷菌）。經(jīng)PCR 鑒定，88株CRE 中，共68株攜帶碳青霉烯酶基因，包括30 株攜帶blaKPC，24 株攜帶blaNDM，9 株攜帶blaIMP-4，5 株攜帶blaVIM。88 株CRE 中，有20 株碳青霉烯酶基因陰性，推測這些菌株耐藥機制可能與罕見/新型碳青霉烯酶、ESBL 和/或AmpC酶合并膜孔蛋白缺失以及外排泵過表達相關(guān)［14］。

mCIM 靈敏度和特異度分別為97.1%（66/68）和100.0%（20/20），2 株分別攜帶blaNDM和blaIMP-4的陰溝腸桿菌為假陰性。實驗菌株接種于含100 μg/ml 氨芐西林的LB 平板上，可排除質(zhì)粒丟失引起的假陰性。同時，經(jīng)微量肉湯稀釋法進行耐藥表型復(fù)核，2株菌對IPM的MICs均為8μg/ml，對美羅培南的 MICs 分別為 8 μg/ml 和 4 μg/ml，故推測 mCIM 假陰性與金屬β-內(nèi)酰胺酶的低活性相關(guān)。本實驗中，mCIM聯(lián)合eCIM 能正確鑒別腸桿菌的金屬β-內(nèi)酰胺酶和絲氨酸酶，操作簡便，結(jié)果易于判斷，在臨床檢測產(chǎn)碳青霉烯酶（尤其是KPC酶和NDM酶）CRE具有較高的應(yīng)用價值［15］。

免疫膠體金試劑盒的總體靈敏度和特異度分別為98.5%（67/68）和100.0%（20/20），陽性預(yù)測值為100.0%（67/67），陰性預(yù)測值為 95.2%（20/21），總符合率為 98.9%（87/88）。KPC、NDM 和VIM 酶試劑盒的靈敏度和特異度均為100.0%。IMP-4 酶試劑盒的靈敏度和特異度分別為88.9%（8/9）和100.0%（20/20）。免疫膠體金試劑盒和mCIM 聯(lián)合eCIM 試驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。與mCIM 聯(lián)合eCIM 試驗相比，免疫膠體金試劑盒檢測碳青霉烯酶的靈敏度和特異度高，操作更為簡便，且10 min 內(nèi)即可查看結(jié)果。該方法可用于快速輔助鑒定碳青霉烯酶的基因型，但陽性或陰性的結(jié)果不能否定存在其他耐藥性機制的可能。不同于NG-Test CARBA 5，本實驗使用的免疫膠體金試劑盒是能檢測單個類型的碳青霉烯酶試劑盒，對于高風(fēng)險耐藥菌（如肺炎克雷伯菌）中特定碳青霉烯酶基因的檢測，其相對成本大大降低［16］。

免疫膠體金試劑盒利用抗原抗體免疫層析技術(shù)快速檢測腸桿菌中的碳青霉烯酶。受方法學(xué)影響，免疫膠體金試劑盒出現(xiàn)假陽性主要與非特異抗原干擾相關(guān)，而出現(xiàn)假陰性的原因主要包括：⑴細菌酶產(chǎn)量不多，抗原濃度低；⑵抗原濃度太高引起鉤狀效應(yīng)；⑶后帶反應(yīng)。本研究中1 株攜帶blaIMP-4的陰溝腸桿菌為假陰性，該菌mCIM 初篩試驗也為假陰性，經(jīng)耐藥表型復(fù)核鑒定為CRE，推測假陰性與IMP-4 酶低表達量有關(guān)。然而，增加菌液濃度進一步進行實驗，結(jié)果仍為陰性。

由于不同碳青霉烯酶流行率不同，本研究采用非隨機對照試驗，實驗菌株所攜帶的碳青霉烯酶基因分布存在偏倚。前期采用PCR 廣泛篩選臨床分離CRE 時發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)攜帶blaIMP-4和blaVIM的CRE 數(shù)目有限。因此，本實驗僅納入9株攜帶blaIMP-4和5株攜帶blaVIM的CRE進行實驗，這對檢測結(jié)果造成一定的偏差。由于未檢出攜帶blaOXA-48的CRE，本實驗未對OXA-48酶試劑盒進行檢測。

綜上所述，免疫膠體金試劑盒（尤其是KPC 和NDM 酶試劑盒）在腸桿菌中靈敏度和特異度均很高，快速、有效且經(jīng)濟，能指導(dǎo)臨床盡早啟動有針對性的抗感染治療方案，有望成為臨床和實驗室快速檢測和診斷CRE的新方法。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。