王鈺 馬文會(huì) 周曉明 侯剛 王秋月

1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,沈陽(yáng) 110001;2中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,沈陽(yáng) 110001;3中日友好醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,北京 100020

特發(fā)性肺纖維化是一種原因不明的慢性進(jìn)行性纖維化間質(zhì)性肺疾病,表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難和肺功能損傷,最終導(dǎo)致死亡[1]。迄今為止,特發(fā)性肺纖維化尚無(wú)治愈方法,因此在肺纖維化預(yù)防和治療中發(fā)揮保護(hù)和治療作用的新型藥物的研究顯得尤為重要。肺纖維化的發(fā)病機(jī)制包括炎癥、上皮細(xì)胞損傷、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)降解和膠原沉積失衡、氧化應(yīng)激等[2-4]。其中上皮損傷和功能障礙的肺泡上皮和相鄰間充質(zhì)之間的串?dāng)_導(dǎo)致組織修復(fù)途徑的異?；虺掷m(xù)激活。有研究表明肺上皮細(xì)胞損傷會(huì)導(dǎo)致一部分的自發(fā)性肺纖維化,肺上皮在驅(qū)動(dòng)早期纖維化發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[5]。另一方面,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)在促進(jìn)肺纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在激活上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞外細(xì)胞因子中,TGF-β1是促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和成纖維細(xì)胞分化的主要誘導(dǎo)因子[6],也是參與肺纖維化發(fā)病機(jī)制的主要促纖維化細(xì)胞因子之一[7]。

甘氨酸-組氨酸-賴氨酸 (glycyl-L-histidyl-Llysine,GHK)是一種人血漿銅結(jié)合肽,GHK 在皮膚、毛囊、胃和腸內(nèi)層、骨組織中有促進(jìn)傷口愈合和組織再生的作用[8-9]。增加膠原蛋白、核心蛋白聚糖、血管生成和神經(jīng)生長(zhǎng),具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛和抗焦慮的作用,并且能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分泌營(yíng)養(yǎng)因子[10]。GHK 已被推薦為轉(zhuǎn)移性癌癥、COPD、炎癥、急性肺損傷的治療方法[11-12]。它對(duì)銅有很強(qiáng)的親和力,很容易形成螯合物GHKCu,從而提高GHK 的生物利用度[13-14]。因此,本研究旨在探討GHK-Cu 螯合物對(duì)博來(lái)霉素(bleomycin,BLM)誘導(dǎo)肺纖維化的保護(hù)作用,以及對(duì)TGF-β1 通路的作用機(jī)制,為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 實(shí)驗(yàn)性研究。主要試劑:BLM 購(gòu)自大連美倫生物科技有限公司,GHK-Cu(純度＞95%)購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司,E-cadherin 抗 體、α-平 滑 肌 肌 動(dòng) 蛋 白 (alpha smooth muscle actin,α-SMA)抗體、β-actin購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公 司,TGF-β1 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司,山羊抗兔IgG、山羊抗大鼠IgG 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,TGF-β1酶 聯(lián) 免 疫 吸 附 試 驗(yàn) (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司;BCA 蛋白測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、ECL 發(fā)光液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,免疫組織化學(xué)試劑盒(鼠/兔)、DAB 顯色試劑盒、Masson染色試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,HE 染色試劑盒購(gòu)自大連美倫生物科技有限公司。

1.2 檢測(cè)儀器 Leica輪轉(zhuǎn)式自動(dòng)脫水機(jī),Carl Zeiss Microscopy Gmb H 生物顯微鏡,Axio-Observer A1生物顯微鏡,Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀,DNR Bio-imaging system 凝膠成像儀。

1.3 方法

1.3.1 小鼠分組造模給藥 選取健康雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠32只,體質(zhì)量18～22 g,購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。隨機(jī)分為4 組 (每組8只):(1)正常對(duì)照組;(2)BLM 組;(3)BLM+0.2μg·g-1·d-1GHK-Cu 組 (低劑量GHK-Cu組);(4)BLM+20μg·g-1·d-1GHK-Cu組 (高劑量GHK-Cu組)。將3 mg/kg BLM 注入50μl磷酸緩沖鹽溶液中,通過(guò)氣管灌注到小鼠中,以制備肺纖維化模型。正常對(duì)照組小鼠經(jīng)氣管灌注等體積的磷酸緩沖鹽溶液。于造模后第4天開(kāi)始進(jìn)行腹膜內(nèi)注射給藥,使用磷酸緩沖鹽溶液作為溶劑。在BLM+GHK-Cu治療組中,隔天腹膜內(nèi)注射給藥1次;正常對(duì)照組小鼠腹膜內(nèi)注射等體積的磷酸緩沖鹽溶液。GHK-Cu 的選定劑量基于人體血漿中GHK 的濃度含量以及先前的研究。第21 天對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死。將部分左肺固定在4%多聚甲醛中,用于HE和Masson染色。收集部分右肺使用冷凍包埋劑固定,用于隨后的免疫熒光染色。并將部分右肺保存于-80 ℃,用于隨后的蛋白質(zhì)印跡及ELISA。

1.3.2 HE染色 將肺組織用多聚甲醛固定24～48 h后流水沖洗6 h,脫水、包埋并切成4μm 切片,放入烤箱烘干。將切片先放置于二甲苯中脫蠟,然后依次放入無(wú)水乙醇、95%、90%、80%、70%、50%酒精中脫水,經(jīng)過(guò)蒸餾水水化后分別將切片放入蘇木素、鹽酸酒精,伊紅中進(jìn)行染色,再經(jīng)蒸餾水沖洗后入50%、70%、80%、90%酒精,無(wú)水乙醇,最后經(jīng)二甲苯透明處理,取出后在載玻片中央滴入一滴中性樹膠后用蓋玻片封片,晾干后放在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.3 Masson染色 將肺組織用多聚甲醛固定24～48 h后流水沖洗6 h,脫水、包埋并切成4μm切片,放入烤箱烘干?？鞠渲锌? h后將切片放置于二甲苯中脫蠟,然后依次放入無(wú)水乙醇、95%、90%、85%、75%酒精中脫水,經(jīng)過(guò)蒸餾水水化后,分別用Masson 復(fù)合染色液、磷鉬酸、苯胺藍(lán)、分化液進(jìn)行染色,再入75%、85%、90%、95%酒精、無(wú)水乙醇,最后經(jīng)二甲苯透明處理,取出后在載玻片中央滴入一滴中性樹膠后用蓋玻片封片,晾干后放在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色 將肺組織用多聚甲醛固定24～28 h 后流水沖洗6 h,脫水、包埋成蠟塊,并切成4μm 切片,放入烤箱烘干。烤箱中烤6 h后放置于二甲苯中脫蠟,然后依次放入無(wú)水乙醇、95%、90%、85%、75%酒精中脫水,經(jīng)過(guò)蒸餾水水化后,應(yīng)用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù),微薄修復(fù)30 min后,自然冷卻至室溫,根據(jù)說(shuō)明書應(yīng)用免疫組織化學(xué)試劑盒進(jìn)行染色,應(yīng)用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色,顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察。應(yīng)用蘇木素對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。應(yīng)用光學(xué)顯微鏡對(duì)切片觀察。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡 將收集的小鼠肺組織于冰上剪碎后加RIPA 裂解液,制成肺組織勻漿,使用BCA 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。應(yīng)用SDSPAGE凝膠對(duì)蛋白樣品進(jìn)行分離,將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,分別用抗體4℃過(guò)夜。次日,山羊抗兔或抗大鼠的二抗室溫孵育1 h。ECL 發(fā)光,應(yīng)用Image J對(duì)所獲得的條帶進(jìn)行分析。

1.3.6 ELISA 將收集的小鼠肺組織于冰上剪碎后加裂解液,制成肺組織勻漿。應(yīng)用ELISA 試劑盒,嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作,采用雙抗體夾心法。根據(jù)樣品OD 值,由標(biāo)準(zhǔn)曲線算出所測(cè)樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Graph Pad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量的變化 與正常對(duì)照組相比,BLM 顯著降低了小鼠的體質(zhì)量。GHK-Cu預(yù)處理組可減輕小鼠的體質(zhì)量的下降。見(jiàn)圖1。

圖1 GHK-Cu對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)纖維化小鼠體質(zhì)量的影響

2.2 各組小鼠肺組織病理及肺損傷程度的改變觀察各組小鼠肺組織的組織病理學(xué)變化 (圖2),可見(jiàn)正常對(duì)照組肺泡組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡壁薄而透明,無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);BLM 組的肺泡結(jié)構(gòu)被破壞,肺泡空間增大,嚴(yán)重變形增厚,肺泡壁增厚,肺泡骨架受損,呈現(xiàn)出扭曲的肺部結(jié)構(gòu),肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞浸潤(rùn);在GHKCu預(yù)處理組中,隨著炎癥細(xì)胞的減少和肺泡結(jié)構(gòu)的恢復(fù),炎癥改變被部分逆轉(zhuǎn)。同時(shí)與正常對(duì)照組相比,BLM 組小鼠有明顯的肺損傷,GHK-Cu預(yù)處理減輕了小鼠的肺損傷程度(圖3)。依據(jù)Smith評(píng)分,GHK-Cu預(yù)處理組的肺組織纖維化評(píng)分較BLM 組明顯減低(圖4)。高、低2個(gè)劑量組相比較肺損傷程度不存在劑量依賴性。

圖2 各組小鼠肺組織的組織病理學(xué) A、E、I:正常對(duì)照組;B、F、J:博來(lái)霉素組;C、G、K:低劑量GHK-Cu組;D、H、L:高劑量GHK-Cu組 ×40 (A～D) ×100 (E～H) ×200 (I～L)

圖4 各組小鼠肺組織纖維化評(píng)分

2.3 各組小鼠肺組織膠原蛋白沉積的改變 在BLM 組中,扭曲的肺部結(jié)構(gòu)被Masson染色藍(lán)染,而在正常對(duì)照組中,完整的肺部結(jié)構(gòu)未呈現(xiàn)藍(lán)色膠原蛋白染色。相比之下,GHK-Cu 預(yù)處理組小鼠的肺部Masson 染色切片顯示,膠原蛋白沉積減弱,并伴有肺形態(tài)的部分恢復(fù)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組小鼠肺組織膠原蛋白沉積的改變 A:正常對(duì)照組;B:博來(lái)霉素組;C:低劑量GHK-Cu組;D 高劑量GHK-Cu組Masson ×100

2.4 各組小鼠肺組織E-cadherin 和α-SMA 表達(dá)的比較 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,BLM 組上皮標(biāo)志物E-cadherin與正常對(duì)照組相比明顯減少,GHK-Cu預(yù)處理一定程度上減弱了上皮標(biāo)志物Ecadherin的減少(圖6)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果 (圖7)顯示,對(duì)照組相比,BLM 組中上皮標(biāo)志物Ecadherin表達(dá)下降,間充質(zhì)標(biāo)志物α-SMA 表達(dá)增加,GHK-Cu 的預(yù)處理可以增加E-cadherin 的表達(dá)同時(shí)減少α-SMA 的表達(dá),這與E-cadherin免疫組織化學(xué)染色結(jié)果基本一致。GHK-Cu 的高、低劑量預(yù)處理組間不存在劑量依賴性。

圖6 各組小鼠肺組織E-cadherin表達(dá) A:正常對(duì)照組;B:博來(lái)霉素組;C:低劑量GHK-Cu組;D:高劑量GHK-Cu組 免疫組織化學(xué)染色 ×200

圖7 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)各組小鼠肺組織中E-cadherin、α-SMA 的蛋白表達(dá)水平 A:電泳圖;B:E-cadherin 蛋白相對(duì)表達(dá);C:α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)

2.5 各組小鼠肺組織TGF-β1的比較 結(jié)果 (圖8)顯示BLM 組小鼠肺勻漿中TGF-β1的表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯增高,GHK-Cu 預(yù)處理組小鼠TGF-β水平與BLM 組相比減低。同時(shí)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)結(jié)果 (圖9)發(fā)現(xiàn)BLM 組小鼠肺組織中TGF-β1的蛋白表達(dá)明顯增加,經(jīng)過(guò)GHK-Cu預(yù)處理后TGF-β1的蛋白表達(dá)減少,這與ELISA得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。但GHK-Cu高劑量組和低劑量組間不存在劑量依賴性。

圖8 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)各組小鼠肺組織中TGF-β1 的蛋白表達(dá)水平 A:電泳圖;B:柱狀圖

圖9 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠肺組織勻漿中TGF-β1的水平

3 討論

特發(fā)性肺纖維化是一種肺部異常的纖維增生性肺疾病,導(dǎo)致肺泡變形,肺功能喪失,患者確診后的病死率依舊居高不下[15],并且特發(fā)性肺纖維化的致病機(jī)制尚不清楚。用于治療白血病和睪丸癌等多種癌癥的BLM 已被廣泛用于誘發(fā)動(dòng)物肺纖維化,是評(píng)價(jià)候選藥物抗纖維化作用最常用的小鼠模型[16-17]。本研究擬探索一種新的治療方法,通過(guò)改善COPD 患者上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象來(lái)改善纖維化。

近年來(lái),小分子肽在藥物發(fā)現(xiàn)方面受到了廣泛的關(guān)注。GHK 是人體血漿中的正常組分,存在于人體血漿、唾液和尿液中[18]。筆者前期研究中發(fā)現(xiàn)GHK 通 過(guò)TGF-β1和IGF-1 途 徑 抑 制BLM 致肺纖維化進(jìn)程、炎癥反應(yīng)[19]。GHK 螯合物GHKCu可以提高其生物利用度,加速再生過(guò)程,促進(jìn)傷口愈合,增強(qiáng)其抗氧化和抗炎作用[20]。因此,筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)研究GHK-Cu對(duì)BLM 誘導(dǎo)的肺纖維化的保護(hù)作用。研究結(jié)果證實(shí)通過(guò)給予GHKCu干預(yù)BLM 致肺纖維化小鼠,發(fā)現(xiàn)GHK-Cu可以減少肺泡結(jié)構(gòu)破壞,減輕肺纖維化、肺損傷程度,并且可以減輕炎癥程度。

在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中,GHK-Cu 通過(guò)抑制急性肺損傷體內(nèi)和體外NF-κBp65和p38 MAPK 信號(hào)傳導(dǎo),降低了活性氧的產(chǎn)生,增加了超氧化物歧化酶的活性,同時(shí)降低了TNF-α和IL-6的產(chǎn)生。此外,GHK-Cu減弱了脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的肺組織學(xué)改變,抑制了炎癥細(xì)胞向肺實(shí)質(zhì)的浸潤(rùn)。GHK-Cu 通過(guò)抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)而在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中具有保護(hù)作用[21]。本研究給予GHK-Cu干預(yù)BLM致肺纖維化小鼠,觀察上皮細(xì)胞標(biāo)志物Ecadherin,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明GHK-Cu 可以增加Ecadherin的表達(dá)同時(shí)減少α-SMA 的表達(dá),亦證實(shí)了GHK-Cu對(duì)肺上皮細(xì)胞的保護(hù)性作用。在大鼠腎小球腎炎模型中,GHK 已被證實(shí)可以改善纖維性組織損傷[22]。筆者前期的研究中也發(fā)現(xiàn)GHK可能通過(guò)IGF-1和TGF-β1 信號(hào)通路增加BLM 致肺纖維化中的E-cadherin 及減少α-SMA 的表達(dá)[19]。研究表明,GHK-Cu可能是通過(guò)提供銅來(lái)提高GHK 抗氧化酶水平和超氧化物歧化酶的活性[23]。另一方面GHK-Cu還可以與鐵釋放的鐵蛋白通道結(jié)合,在物理上阻止鐵的釋放。從而抑制受損組織中的鐵蛋白釋放,減輕炎癥和預(yù)防微生物感染,因此GHK-Cu在創(chuàng)傷中顯示出更強(qiáng)的抗氧化的功能[24]。與其他的研究結(jié)果一致,筆者發(fā)現(xiàn)GHK-Cu的治療能顯著抑制BLM 誘導(dǎo)的慢性肺炎癥和纖維化,并增加BLM 致肺纖維化中的Ecadherin及減少α-SMA 的表達(dá)。并且這些改變程度與GHK-Cu劑量不相關(guān)。筆者所在團(tuán)隊(duì)首次將GHK-Cu作為抗纖維化治療藥物應(yīng)用于BLM 致小鼠肺纖維化的研究中,實(shí)驗(yàn)證明了GHK-Cu對(duì)肺纖維化的保護(hù)作用,并為GHK-Cu對(duì)纖維化疾病的潛在治療作用提供了新的證據(jù)。

許多研究表明,根據(jù)細(xì)胞環(huán)境的不同,TGF-β1通路在創(chuàng)面愈合和器官纖維化中發(fā)揮重要作用[25-26]。TGF-β1信號(hào)是特發(fā)性肺纖維化中細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量產(chǎn)生、沉積、成纖維細(xì)胞增殖和向肌成纖維細(xì)胞分化的主要誘導(dǎo)因子。有研究發(fā)現(xiàn),用GHK 處理COPD 患者的成纖維細(xì)胞可以減少TGF-β1的產(chǎn)生[12]。本研究顯示氣管灌注BLM 21 d后肺組織中TGF-β1的蛋白水平顯著提高,GHK-Cu的治療可以減少TGF-β1 的表達(dá)。與先前的研究結(jié)果一致,GHK-Cu對(duì)TGF-β1的表達(dá)有抑制作用。GHK-Cu對(duì)肺組織中TGF-β1 蛋白水平的影響與其對(duì)肺組織病理改變的影響是一致的。這些發(fā)現(xiàn)表明,GHK-Cu可以通過(guò)TGF-β1途徑減輕肺上皮細(xì)胞損傷,從而減少上皮細(xì)胞向產(chǎn)生膠原的肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變。本研究首次揭示了GHK-Cu可能通過(guò)影響TGF-β1信號(hào)通路來(lái)預(yù)防肺纖維化。

綜上所述,GHK-Cu螯合物可以減輕BLM 誘導(dǎo)的小鼠肺組織纖維化,能減輕肺部損傷及炎癥浸潤(rùn)、膠原沉積及肺上皮細(xì)胞損傷,這一作用可能與抑制TGF-β1信號(hào)通路相關(guān)。提示GHK-Cu 螯合物對(duì)BLM 誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化具有保護(hù)作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突