賴(lài)曉健，彭 帥，張 哲，李忠琴

( 1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021； 2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021； 3.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門(mén) 361000 )

鰻鱺(Anguillajaponica)為生殖洄游性魚(yú)類(lèi),在降海洄游過(guò)程中性腺逐步發(fā)育成熟，并在大海中完成排卵、受精和胚胎發(fā)育。實(shí)驗(yàn)室條件下，人工養(yǎng)殖或下海的親鰻需要人工誘導(dǎo)性腺才能發(fā)育成熟。應(yīng)用外源激素對(duì)鰻鱺性腺進(jìn)行人工誘導(dǎo)，結(jié)果表明，雌魚(yú)的性腺較雄魚(yú)更難誘導(dǎo)成熟，所需的外源激素劑量和誘導(dǎo)時(shí)間更長(zhǎng)[1]。因此，現(xiàn)有的研究針對(duì)雌性鰻鱺較多，而涉及雄性鰻鱺的較少[1]。然而在鰻鱺的人工繁育中，雌、雄鰻鱺性腺發(fā)育的同步性也是重要的影響因素。

目前，人工誘導(dǎo)鰻鱺性腺發(fā)育成熟的主要方法是注射鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)或鮭魚(yú)垂體勻漿液和人絨毛膜促性腺激素(HCG)混合液[2]。也有學(xué)者應(yīng)用埋植或注射雄激素的方法誘導(dǎo)鰻鱺性腺發(fā)育和成熟[1-3]。其中埋植甲基睪酮(MT)6次后(90 d)，雄魚(yú)性成熟比達(dá)88.89%；但是埋植需要每15 d操作1次[3]。為減少對(duì)親魚(yú)的機(jī)械損傷，筆者通過(guò)改變給藥方式，在養(yǎng)殖水體中加入甲基睪酮，探索其對(duì)鰻鱺雄魚(yú)性腺發(fā)育的影響，并為改進(jìn)鰻鱺雄魚(yú)的人工催熟技術(shù)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

由于鰻鱺的年齡、生長(zhǎng)環(huán)境和激素處理的方法和時(shí)長(zhǎng)不同，導(dǎo)致性腺發(fā)育的程度各不相同。西太平洋沿岸不同地區(qū)鰻鱺親魚(yú)的平均下海年齡為(5.2±0.8)～(8.3±1.6)齡[4]，所以試驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的7齡鰻鱺雄魚(yú)。

鰻鱺親魚(yú)取自集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院海水試驗(yàn)場(chǎng)，全長(zhǎng)(61.00±1.00) cm，體質(zhì)量(266.45±18.65) g。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

60尾親魚(yú)隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，采用直徑1.5 m、高1.0 m的圓形養(yǎng)殖桶為試驗(yàn)容器，水量1000 L，水體為鹽度35的海水。甲基睪酮標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司(MB1943-S)，稱(chēng)取50 mg甲基睪酮先溶解于5 mL無(wú)水乙醇，再加入養(yǎng)殖水體中，使試驗(yàn)組甲基睪酮最終質(zhì)量濃度為50 μg/L，對(duì)照組加入5 mL無(wú)水乙醇。對(duì)照組和試驗(yàn)組各設(shè)2個(gè)平行組，每桶10尾親魚(yú)。試驗(yàn)時(shí)間為45 d，其間不投喂，對(duì)照組和試驗(yàn)組每5 d換水1/2，同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)的甲基睪酮或無(wú)水乙醇，試驗(yàn)期間控制水溫(21±1) ℃。試驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組和試驗(yàn)組各隨機(jī)采樣5尾。

1.3 生物學(xué)數(shù)據(jù)和組織切片

麻醉試驗(yàn)魚(yú)，測(cè)量體質(zhì)量和全長(zhǎng)。用注射器尾靜脈取血。解剖取性腺及肝臟，稱(chēng)量質(zhì)量，并計(jì)算性腺指數(shù)(wGSI，%)和肝體比(wHSI，%)：

wGSI=m1/m×100%

wHSI=m2/m×100%

式中，m為體質(zhì)量，m1為性腺質(zhì)量，m2為肝臟質(zhì)量。

取部分性腺組織用新配置的4%多聚甲醛固定8～12 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。連續(xù)切片5 μm，蘇木精—伊紅染色，Leica DM5500B顯微鏡觀察和拍照。

1.4 ELISA法測(cè)定血清中雌二醇和11-酮基睪酮的質(zhì)量濃度

取全血標(biāo)本室溫放置2 h或4 ℃過(guò)夜后于3068 r/min(離心半徑9.5 cm)離心15 min，取上清液置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)Estradiol ELISA試劑盒和11-Keto Testosterone EIA試劑盒(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan, USA)說(shuō)明書(shū)的操作方法檢測(cè)血清中雌二醇和11-酮基睪酮的質(zhì)量濃度。對(duì)照組和試驗(yàn)組間的差異用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 鰻鱺精巢的發(fā)育情況

試驗(yàn)結(jié)束后，輕壓試驗(yàn)組魚(yú)腹部，尚不能擠出精液。測(cè)得試驗(yàn)組性腺指數(shù)為(1.63±0.68)%，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，約為對(duì)照組的8倍。試驗(yàn)組肝體比為(1.49±0.10)%，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)(表1)。

表1 甲基睪酮暴露對(duì)鰻鱺精巢發(fā)育的影響 %

剪開(kāi)魚(yú)腹部，可見(jiàn)對(duì)照組精巢處于Ⅱ期，整體為紅色細(xì)帶狀，布滿(mǎn)血管，邊緣為鋸齒狀(圖1a)。試驗(yàn)組精巢處于Ⅳ期，為乳白色的片狀(圖1b)。組織切片可觀察到對(duì)照組精小囊處于精子發(fā)生的精原細(xì)胞增殖期(S1期)，生殖細(xì)胞多為精原細(xì)胞，細(xì)胞呈圓形，核噬堿性；精巢出現(xiàn)少量精母細(xì)胞，其細(xì)胞核染色更深(圖2a)。試驗(yàn)組精巢的精小囊發(fā)育變大，處于精子發(fā)生的精子形成期(S5期)。精母細(xì)胞分布在精小囊壁上，精小囊中充滿(mǎn)精細(xì)胞，并已出現(xiàn)游離的精子(圖2b)。

圖1 鰻鱺精巢組織Fig.1 Testis of Japanese eel A. japonicaa.對(duì)照組精巢； b.試驗(yàn)組精巢； 箭頭所示為精巢.a.testis in the control group; b.testis in Japanese eel exposed to MT group; arrows show the testis.

圖2 鰻鱺精巢組織切片F(xiàn)ig.2 Photomicrographs of histological sections of testis in Japanese eel A. japonicaa.對(duì)照組精巢組織； b.試驗(yàn)組精巢組織； SPG.精原細(xì)胞； SPC.精母細(xì)胞； SPD.精子細(xì)胞； SPZ.精子.a.testis in the control group; b.testis in Japanese eel exposed to MT group; SPG.spermatogonia; SPC.spermatocyte; SPD.spermatid; SPZ.spermatozoon.

2.2 血清中雌二醇和11-酮基睪酮的質(zhì)量濃度

試驗(yàn)組鰻鱺血清中雌二醇質(zhì)量濃度為(182.06±30.52) pg/mL，顯著高于對(duì)照組的質(zhì)量濃度(3.69±0.72) pg/mL (P<0.05)；11-酮基睪酮質(zhì)量濃度為(7.30±2.15) pg/mL，與對(duì)照組的質(zhì)量濃度(5.67±0.37) pg/mL相比無(wú)顯著差異(圖3)。

圖3 鰻鱺血清11-酮基睪酮和雌二醇質(zhì)量濃度Fig.3 Serum 11-KT and E2 levels in Japanese eel A. japonica相同上標(biāo)字母表示無(wú)顯著性差異(P>0.05)，不同上標(biāo)字母表示有顯著性差異(P<0.05).Means with the same letter are not significant differences (P>0.05), and means with different letters are significant differences (P<0.05).

3 討 論

鰻鱺的人工繁育技術(shù)是世界性的難題，我國(guó)自20世紀(jì)70年代開(kāi)始開(kāi)展鰻鱺的人工繁殖技術(shù)研究，通過(guò)外源激素誘導(dǎo)得到性腺發(fā)育成熟的親鰻，并得到受精卵和初孵仔魚(yú)，但目前仔魚(yú)很難度過(guò)開(kāi)口期，存活時(shí)間大多僅7～20 d。日本自20世紀(jì)60年代開(kāi)始相關(guān)研究，2010年在實(shí)驗(yàn)室獲得子二代的初孵仔魚(yú)[5]。但是由于鰻苗產(chǎn)量低和高昂的柳葉鰻培育成本，目前還不能大批量培育白仔鰻苗，無(wú)法達(dá)到鰻鱺商業(yè)化養(yǎng)殖的要求，因此相關(guān)的技術(shù)需要進(jìn)一步研究，如親魚(yú)人工催熟催產(chǎn)技術(shù)的優(yōu)化，卵子質(zhì)量的提高，柳葉鰻的培育技術(shù)及其理化條件的優(yōu)化，柳葉鰻期的縮短等[6]。相對(duì)雌鰻，雄鰻的人工催熟和催產(chǎn)技術(shù)較為簡(jiǎn)易，但仍需重復(fù)多次注射操作，因此容易造成機(jī)械傷害從而降低精子的質(zhì)量。

3.1 甲基睪酮暴露促進(jìn)鰻鱺精巢發(fā)育

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，甲基睪酮暴露45 d促進(jìn)了鰻鱺雄魚(yú)的精巢發(fā)育，精巢從Ⅱ期發(fā)育至Ⅳ期，此時(shí)精巢以精細(xì)胞為主，與長(zhǎng)鰭裸頰鯛(Lethrinuserythropterus)和長(zhǎng)臀(Cranoglanisbouderius)的Ⅳ期精巢相似[7-8]。精小囊從精原細(xì)胞增殖期發(fā)育至精子形成期，已出現(xiàn)游離的精子。方瓊珊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，鰻鱺雄魚(yú)按鯉魚(yú)垂體0.2 mg/尾+人絨毛膜促性腺激素25 IU/尾誘導(dǎo)35 d后，精小葉中有大量初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞、少數(shù)精子細(xì)胞以及管腔中存在少量精子；張潔明等[10]采用鯉魚(yú)腦垂體0.5 mg/kg+人絨毛膜促性腺激素50 IU/kg注射催熟鰻鱺雄魚(yú)，在注射7針后，63.2%的雄魚(yú)可發(fā)育至精子出現(xiàn)期。上述研究中雄魚(yú)的精巢發(fā)育期與本試驗(yàn)中試驗(yàn)組雄魚(yú)近似。鰻鱺雄魚(yú)腹腔埋植甲基睪酮(50 μg/g)3次(45 d)后，雄魚(yú)成熟率達(dá)到41.67%[3]。魚(yú)體內(nèi)埋植的甲基睪酮作用更為迅速和直接，因而誘導(dǎo)效果優(yōu)于本試驗(yàn)，但本試驗(yàn)的操作簡(jiǎn)便，也易于生產(chǎn)應(yīng)用。歐洲鰻鱺(A.anguilla)雄魚(yú)的相關(guān)研究顯示，經(jīng)腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(1.5 IU/g)4周后，性腺指數(shù)即出現(xiàn)顯著升高，約為4%，高于本試驗(yàn)結(jié)果，但此時(shí)精巢發(fā)育大多處于Ⅳ期[11]。人絨毛膜促性腺激素的生理作用與促黃體生成素(LH)近似，與促黃體生成素在性腺細(xì)胞中共享一個(gè)共同的受體LHR，人絨毛膜促性腺激素通過(guò)與精巢中Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞膜上的LHR受體特異性的結(jié)合[9]，刺激精巢合成和分泌睪酮從而間接起到促進(jìn)精子發(fā)生的作用[12]，而甲基睪酮可直接作用于性腺，促進(jìn)精子發(fā)生[13]，效果更為直接。

3.2 甲基睪酮暴露對(duì)鰻鱺血清11-酮基睪酮和雌二醇水平的影響

魚(yú)類(lèi)精子的發(fā)生過(guò)程需要內(nèi)分泌激素的調(diào)控才能完成，體外試驗(yàn)證明雄激素的氧化物11-酮基睪酮在鰻鱺精子發(fā)生的整個(gè)過(guò)程均起到推動(dòng)作用[14]。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)甲基睪酮暴露45 d后，雄魚(yú)血清11-酮基睪酮質(zhì)量濃度較對(duì)照組未顯著升高。已有的研究表明，11-酮基睪酮在精原細(xì)胞的增殖過(guò)程起主要作用[12,14-17]，但對(duì)減數(shù)分裂過(guò)程作用不明顯。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組精子發(fā)生處于精子形成期，屬于精子發(fā)生的晚期，此時(shí)11-酮基睪酮的含量與對(duì)照組相比無(wú)顯著升高，推測(cè)此時(shí)11-酮基睪酮的作用不明顯，甲基睪酮轉(zhuǎn)化為11-酮基睪酮的效率很低。同樣，在歐洲鰻鱺雄魚(yú)中，雖然人絨毛膜促性腺激素注射3周后，血清11-酮基睪酮含量達(dá)到峰值，但是隨后逐漸下降，在人絨毛膜促性腺激素注射7周后(精巢處于Ⅴ～Ⅵ期)，與注射前含量相比無(wú)顯著差異[11]。其他魚(yú)類(lèi)的研究也顯示，雄魚(yú)開(kāi)始排精后，血清11-酮基睪酮含量下降，如北極紅點(diǎn)鮭(Salvelinusalpinus)[18]和遠(yuǎn)東哲羅鮭(Huchoperryi)[19]。

試驗(yàn)組雌二醇質(zhì)量濃度顯著高于對(duì)照組，推測(cè)是部分甲基睪酮通過(guò)芳香化酶的作用轉(zhuǎn)化成雌二醇。相似的研究發(fā)現(xiàn)，赤點(diǎn)石斑魚(yú)(Epinephelusakaara)埋植甲基睪酮8周后，性腺芳香化酶活性和血清雌二醇質(zhì)量濃度同步升高[20]。以往的研究顯示，雌二醇雖然是一種雌激素，但是在雄魚(yú)精子發(fā)生過(guò)程中也是不可或缺的。體內(nèi)和體外試驗(yàn)均表明，10 pg/mL以上質(zhì)量濃度的雌二醇就能夠促進(jìn)鰻鱺精原干細(xì)胞的更新[2]。在青鳉(Oryziaslatipes)[21]的研究中發(fā)現(xiàn)，低濃度(0.01 nmol/L和1 nmol/L)的17α-乙炔雌二醇能刺激體外培養(yǎng)的精巢中精原干細(xì)胞的增殖，高濃度的雌二醇(100 nmol/L)反而起抑制作用。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的血清雌二醇質(zhì)量濃度為(182.06±30.52) pg/mL[(0.67±0.11) nmol/L]，此質(zhì)量濃度的雌二醇可促進(jìn)精子發(fā)生。雌二醇的作用機(jī)理是通過(guò)升高視黃醇結(jié)合蛋白Ⅰ、Ⅱ基因的表達(dá)以調(diào)控視黃酸的合成，從而調(diào)控未分化的精原細(xì)胞增殖和分化[22]。

甲基睪酮埋植的鰻鱺雄魚(yú)腦部和垂體促性腺激素釋放激素GnRH含量也顯著高于對(duì)照組[3]。推測(cè)甲基睪酮暴露也可能對(duì)下丘腦—垂體軸產(chǎn)生正反饋調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)下丘腦促性腺激素釋放激素的合成和分泌，進(jìn)而促進(jìn)精巢的發(fā)育和成熟。在歐洲鰻鱺中，經(jīng)人絨毛膜促性腺激素注射3周后，雄魚(yú)中腦和間腦的mGnRH表達(dá)量達(dá)到峰值，Pearanda等[11,23]推測(cè)11-酮基睪酮同樣通過(guò)正反饋調(diào)節(jié)作用提高GnRH的表達(dá)量。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用甲基睪酮浸泡的方法，在已有研究的基礎(chǔ)上改變外源激素的種類(lèi)和給藥方式，減少人工操作帶來(lái)的機(jī)械損傷，通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間的微量甲基睪酮的暴露，試驗(yàn)組魚(yú)精巢發(fā)育至Ⅳ期，精子發(fā)生至精子形成期，已出現(xiàn)游離的精子，說(shuō)明甲基睪酮能夠極大地促進(jìn)精巢的發(fā)育。如果后期通過(guò)注射人絨毛膜促性腺激素和鯉魚(yú)垂體再進(jìn)行催熟，所需的劑量和針數(shù)相比對(duì)照組雄魚(yú)可大幅減少。下一步的研究可通過(guò)優(yōu)化組合不同的激素及其劑量，以進(jìn)一步促進(jìn)精巢發(fā)育，提高成熟度。