TGFβ1/Smad3信號通路在帕瑞昔布鈉對CCI模型大鼠神經(jīng)病理性疼痛影響中的作用

劉建輝 張幫建 李定海

(1.攀枝花市仁和區(qū)人民醫(yī)院麻醉科，四川 攀枝花 617061；2.攀枝花市中心醫(yī)院麻醉科，四川 攀枝花 617067)

神經(jīng)病理性疼痛是以異常性疼痛、痛覺過敏和自發(fā)性疼痛為特征的一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率約為3.3%～17.9%[1]。神經(jīng)病理性疼痛主要是由物理性傷害、感染和自身免疫等因素引起的神經(jīng)損傷或功能障礙導(dǎo)致，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量，且目前仍然缺乏有效的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)，帕瑞昔布鈉是一種環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)的高選擇性抑制劑，通過抑制花生四烯酸向前列腺素轉(zhuǎn)化，從而降低神經(jīng)炎癥，對于神經(jīng)病理性疼痛具有較好的緩解作用，但是其作用機(jī)制尚缺乏研究[2-3]。多項(xiàng)研究證實(shí)，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)可以有效的抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增殖和活化，下調(diào)神經(jīng)炎癥水平[4-5]。因此，本研究認(rèn)為TGFβ1及下游的Smad3信號通路可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，從而在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)，并證實(shí)帕瑞昔布鈉通過激活TGFβ1/Smad3信號通路緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛，為帕瑞昔布鈉的臨床治療提供了新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級健康雄性SD大鼠40只，8～12周齡，體重180～220g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度22～24℃，相對濕度50%～60%，自然照明，自由飲食和飲水，定時(shí)更換墊料和籠具，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(SC組)、神經(jīng)病理性疼痛組(CCI組)、帕瑞昔布鈉組(PAR組)、帕瑞昔布鈉+TGFβ1抑制劑1D11組(1D11組)4組，每組各10只。本研究對大鼠的處置符合動(dòng)物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型的構(gòu)建 參照文獻(xiàn)報(bào)道[6]通過慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎(chronic sciatic nerve constriction injury，CCI)制備大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型。采用10%的水合氯醛腹腔注射誘導(dǎo)大鼠麻醉，俯臥位固定，剃去右大腿的毛發(fā)并消毒，沿股骨外側(cè)縱向切開皮膚，鈍性分離肌層，將坐骨神經(jīng)主干游離出約7 mm，采用4-0鉻制腸線分別環(huán)扎4道，間隔約1 mm，結(jié)扎后可見小腿肌肉輕度顛動(dòng)，將肌肉與皮膚逐層縫合。

1.3 各組處理方法 SC組僅游離坐骨神經(jīng)，不進(jìn)行結(jié)扎,CCI組、PAR組與1D11組均行神經(jīng)病理性疼痛造模。PAR組在造模后給予10 mg/kg的帕瑞昔布鈉(4 mg/mL，美國Pfizer公司，批號85820012)腹腔注射，連續(xù)7天，給藥劑量與時(shí)間根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道與預(yù)實(shí)驗(yàn)確定[3,7]。1D11組在造模后給予10 mg/kg的帕瑞昔布鈉與1 mg/kg的1D11(0.4 mg/mL，美國R&D Systems公司，MAB1835)腹腔注射，連續(xù)7天。SC組、CCI組則給予同體積的生理鹽水腹腔注射。

1.4 行為學(xué)檢測機(jī)械痛閾和熱痛閾 分別在術(shù)前1天(首次給藥前1天)、術(shù)后3天(首次給藥后3天)、術(shù)后7天(首次給藥后7天)、術(shù)后14天(首次給藥后14天)時(shí)，對各組大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾進(jìn)行檢測。①機(jī)械痛閾：將大鼠放置于金屬的網(wǎng)格籠子中30 min，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境后，采用Electronic von Frey觸覺測痛儀(美國IITC公司，Series 2392)對大鼠的右足底中部進(jìn)行刺激，當(dāng)大鼠出現(xiàn)舔足、縮足、抬足等躲避動(dòng)作時(shí)記錄刺激力度，即為機(jī)械痛閾，每只大鼠重復(fù)測量3次，每次間隔時(shí)間大于10 s，取平均值。②熱痛閾：將大鼠放置于透明的玻璃箱子中30 min，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境后，采用熱測痛儀(美國IITC公司，Series 8)對大鼠的右足底中部進(jìn)行照射，當(dāng)大鼠出現(xiàn)舔足、縮足、抬足等躲避動(dòng)作時(shí)記錄照射時(shí)間，即為熱痛閾，每只大鼠重復(fù)測量3次，每次間隔時(shí)間5 min，取平均值。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測TGFβ1/Smad3信號通路的表達(dá) 在術(shù)后14d完成行為學(xué)檢測后，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉，將大鼠斷頭處死，分離手術(shù)側(cè)L4-6節(jié)段的脊髓背角組織。加入RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0013)對組織進(jìn)行勻漿，4℃下12000 r/min離心10 min，留取上清液，保存于-80℃冰箱。采用BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0012)測定蛋白濃度，取30 μg總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將目的蛋白電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4℃過夜孵育，抗體濃度分別為：兔抗鼠TGFβ1(1 μg/mL，英國Abcam公司，ab92486)、兔抗鼠p-Smad3(0.5 μg/mL，英國Abcam公司，ab52903)、兔抗鼠GAPDH(0.5 μg/mL，英國Abcam公司，ab9485)。次日，TBST洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(0.4 μg/mL，英國Abcam公司，ab6721)，室溫避光孵育1 h，ECL顯色后曝光拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件測定各條帶的灰度值，將對照組中目的蛋白與GAPDH的灰度值之比作為1。

1.6 免疫熒光染色檢測鈣離子接頭蛋白-1(Iba-1)蛋白的表達(dá) 采用4%的多聚甲醛對脊髓背角組織進(jìn)行4℃過夜固定，再使用30%的蔗糖4℃過夜脫水。將樣本放入標(biāo)本托中，加入OCT包埋劑(美國Sakura公司)，液氮速凍后，放入-80℃冰箱中保存。使用冰凍切片機(jī)對組織樣本進(jìn)行連續(xù)切片，制作10 μm厚的冰凍切片，裱于防脫載玻片上。切片用PBS漂洗1次，然后用含有0.3% Triton X-100的5%山羊血清封閉液室溫孵育1 h，吸去血清，滴加兔抗鼠Iba-1抗體(6.32 μg/mL，英國Abcam公司，ab178847)4℃過夜孵育。PBS漂洗3次，滴加Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗兔二抗(2 μg/mL，英國Abcam公司，ab150077)室溫避光孵育1 h，PBS漂洗3次，滴加含DAPI的抗熒光淬滅封片劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行封片，熒光顯微鏡下觀察和拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件測定各組Iba-1的熒光強(qiáng)度值，將對照組的熒光強(qiáng)度值作為1進(jìn)行比較。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測炎癥因子的水平 使用TRIzol提取試劑(美國Invitrogen公司，15596018)從脊髓背角組織中提取總RNA，超微量分光光度計(jì)(美國Thermo公司，NanoDrop 2000)檢測RNA濃度及OD260/280(1.8～2.1)。使用SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System(美國Invitrogen公司，11904018)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：25℃，10 min；42℃，5 min；70℃，15 min；4℃。使用Fast SYBR Green Master Mix(美國Applied Biosystems公司，4385614)進(jìn)行定量PCR，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次；95℃，15 s；60℃，60 s；95℃，15 s。使用2-ΔΔCT法分析結(jié)果，引物合成于上海生工生物工程股份有限公司，具體序列，見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾的比較 各組大鼠在術(shù)前1d時(shí)機(jī)械痛閾與熱痛閾比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與SC組相比較，CCI組在術(shù)后3d、7d、14d時(shí)機(jī)械痛閾與熱痛閾均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CCI組相比較，PAR組在術(shù)后3d、7d、14d時(shí)機(jī)械痛閾與熱痛閾均升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PAR組比較，1D11組在術(shù)后3d、7d、14d時(shí)機(jī)械痛閾與熱痛閾降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾的比較

表2 各組大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾的比較

2.2 各組大鼠TGFβ1/Smad3信號通路表達(dá)水平的比較 SC組和CCI組脊髓背角組織中TGFβ1、p-Smad3表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與CCI組相比較，PAR組脊髓背角組織中TGFβ1、p-Smad3表達(dá)水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PAR組比較，1D11組脊髓背角組織中TGFβ1、p-Smad3表達(dá)水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測TGFβ1/Smad3信號通路的表達(dá)

2.3 各組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度的比較 與SC組相比較，CCI組脊髓背角組織中Iba-1熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；與CCI組相比較，PAR組脊髓背角組織中Iba-1熒光強(qiáng)度明顯減弱；與PAR組比較，1D11組脊髓背角組織中Iba-1熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，見圖3。

圖3 免疫熒光染色檢測Iba-1的表達(dá)(標(biāo)尺：100 μm)

2.4 各組大鼠炎癥因子水平的比較 與SC組相比較，CCI組脊髓背角組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CCI組相比較，PAR組脊髓背角組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與PAR組比較，1D11組脊髓背角組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組大鼠炎癥因子水平的比較

3 討論

目前有幾種治療神經(jīng)病理性疼痛的藥物，包括非甾體類抗炎藥、阿片類藥物、抗驚厥藥、抗抑郁藥等，但是將近三分之二的患者對這些治療均無反應(yīng)，被認(rèn)為具有治療抵抗力[8]。治療藥物研發(fā)的不理想與病理機(jī)制的復(fù)雜性密切相關(guān)[9-10]。中樞敏化是解釋疼痛誘發(fā)的主要機(jī)制，表現(xiàn)為突觸數(shù)量的升高及突觸傳遞的長時(shí)程增強(qiáng)[11]。近年來，學(xué)界認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞活化后向突觸間隙周圍遷移，通過分泌大量的神經(jīng)炎癥因子，導(dǎo)致軸突末梢去極化，是引起中樞敏化的重要機(jī)制[12-13]。因此，從小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的角度去深入挖掘神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)鍵機(jī)制，從而針對性的開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥，可能達(dá)到理想的治療效果。

作為一種COX-2抑制劑，帕瑞昔布鈉具有較好的炎癥抑制效應(yīng)[14-15]。研究表明，它也對神經(jīng)病理性疼痛具有較好的緩解作用，可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，降低脊髓組織中炎癥介質(zhì)的表達(dá)[2-3]。本研究通過慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎的方法構(gòu)建了大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型，結(jié)果也證實(shí)了帕瑞昔布鈉的鎮(zhèn)痛及抗炎效應(yīng)。但是，帕瑞昔布鈉除了抑制COX-2表達(dá)外，是否還通過其他作用機(jī)制發(fā)揮治療效應(yīng)也有待研究。

眾所周知，TGFβ1是一種多功能的細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化、遷移等多種功能，而在免疫調(diào)節(jié)中卻發(fā)揮負(fù)性效應(yīng)，例如TGFβ1功能減弱導(dǎo)致淋巴細(xì)胞過度激活是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的主要發(fā)病機(jī)制[16]。早期有研究發(fā)現(xiàn)，在正常的成年個(gè)體中，TGFβ2和β3在神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中普遍表達(dá)，而TGFβ1卻僅限于腦膜[17]。然而隨后的研究發(fā)現(xiàn)，患有神經(jīng)退行性疾病或缺血性損傷的動(dòng)物大腦中TGFβ1表達(dá)水平顯著上調(diào)[18-19]。近年通過體內(nèi)體外研究發(fā)現(xiàn)，TGFβ1對神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有一系列的生物學(xué)功能，例如TGFβ1可以與膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)等其他營養(yǎng)因子協(xié)同作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)元的存活[20]；可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，降低自由基含量，發(fā)揮抗炎和免疫抑制效應(yīng)[4,21]。由此，本研究提出TGFβ1是否通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，從而在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)，是否參與帕瑞昔布鈉的抗炎與鎮(zhèn)痛機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，雖然造模后TGFβ1的表達(dá)水平并未發(fā)生顯著性變化，但是帕瑞昔布鈉給藥卻可以明顯上調(diào)TGFβ1的表達(dá)，而給予TGFβ1抑制劑1D11則可抑制其表達(dá)上調(diào)。TGFβ1通過與II型跨膜絲氨酸蘇氨酸激酶受體(TGFβRII)結(jié)合而發(fā)出信號，進(jìn)而激活I(lǐng)型受體(TGFβRI)，使下游Smad3發(fā)生磷酸化，進(jìn)而轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，因此p-Smad3是TGFβ1信號的主要介導(dǎo)者[22-23]。本文結(jié)果顯示，p-Smad3的表達(dá)趨勢與上述TGFβ1相一致，證實(shí)了1D11可以有效抑制帕瑞昔布鈉對TGFβ1/Smad3信號通路的激活。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1D11可以逆轉(zhuǎn)帕瑞昔布鈉的鎮(zhèn)痛及抗炎效應(yīng)，證實(shí)了TGFβ1/Smad3信號通路在帕瑞昔布鈉保護(hù)機(jī)制中的重要作用。但是，1D11對帕瑞昔布鈉的鎮(zhèn)痛及抗炎效應(yīng)僅表現(xiàn)為部分抑制，卻不能完全阻斷，提示可能還有其他病理機(jī)制在發(fā)揮作用，未來仍待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本文闡釋了TGFβ1/Smad3信號通路在帕瑞昔布鈉治療大鼠神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮著重要作用，為帕瑞昔布鈉的臨床治療提供了新的理論基礎(chǔ)。此外，TGFβ1/Smad3信號通路可能單獨(dú)作為治療靶點(diǎn)，用于開發(fā)新型藥物，可能具有更大的應(yīng)用價(jià)值。