闕曉慧， 桂蜀華， 鐘清元， 于兵兵， 林 好

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

生地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥根，熟地黃為生地炮制而來。古籍記載熟地以“色黑如漆”的九蒸九曬熟地(下文稱九曬熟地)入藥為佳[1]，現(xiàn)今熟地多采用一次性炮制，包括一次性蒸烘炮制(下文稱一烘熟地)和一次性蒸曬炮制(下文稱一曬熟地)。中醫(yī)認(rèn)為腎主生殖，卵子為生殖之精，熟地傳統(tǒng)功效為補(bǔ)腎填精[2]，課題組前期證明九曬熟地與一烘熟地對卵巢排卵的影響不同，提示地黃未炮制透則會影響卵巢排卵[3]。

生地性寒，熟地性溫，將生地炮制為熟地的目的是為了制約生地的寒性，不同炮制程度的地黃作用物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生改變[4]，其寒熱藥性不同，從而可能使其對卵巢的作用不同。為了進(jìn)一步探究地黃的寒熱藥性對卵巢的影響，本研究將進(jìn)一步比較生地、一曬熟地與九曬熟地三種不同炮制程度的地黃對小鼠卵巢卵泡的影響，并分析可能與寒熱藥性相關(guān)的化學(xué)成分，豐富地黃的藥性理論研究，并為地黃的科學(xué)炮制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF級KM雌性小鼠30只，性成熟，體質(zhì)量(20±2)g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)20180034，動物使用許可證號SYXK(粵)2018-0085，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，維持12 h/12 h明暗交替照明，自由進(jìn)食飲水。

1.2 試劑與藥物 生地黃購于河南省焦作市武陟縣地黃種植戶，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥鑒定教研室吳文如副教授鑒定為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥塊根。蘇木素-伊紅染色液(北京里根生物技術(shù)有限公司)；PBS粉末(武漢博士德生物工程有限公司)；免疫組化筆(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷(純度>98%，北京索萊寶科技有限公司)；FSHR抗體(杭州華安生物技術(shù)有限公司)。甲醇、甲酸(色譜純，德國默克公司)；甲醇(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；福爾馬林(廣州永津生物科技有限公司)。

1.3 儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀、SIL-20A自動進(jìn)樣器、LC-20A色譜工作站(日本島津公司)；STP120梯度脫水機(jī)、Histosta石蠟包埋機(jī)、HM340E半自動輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)、Gemini AS自動染色機(jī)(美國Thermo Fisher公司)；BX53生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；EL204電子分析天平(十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；0.22 μm微孔濾膜(天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 熟地黃制備 取個頭相近的生地若干，洗凈表面泥沙，以0.2 mL/g水潤制4 h，蒸制12 h，曬制7 h，為一次蒸制，所記為一曬熟地半成品，重復(fù)上述步驟8次，得九蒸九曬熟地半成品，切成2～3 mm厚片，置于50 ℃烘箱中干燥7 h，即得，拍照后避光保存于干燥罐中。

2.2 不同炮制程度地黃對小鼠卵巢的影響

2.2.1 藥液制備 取生地或熟地20.0 g，加100 mL蒸餾水煎煮1 h，濾過，濾渣加50 mL蒸餾水煎煮0.5 h，濾過，合并濾液，濃縮至50 mL，制成質(zhì)量濃度為0.4 g/mL的水提液。取媽富隆片1片(0.081 g)，加90 mL蒸餾水溶解，制成質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL的溶液。

2.2.2 分組與給藥 30只小鼠隨機(jī)分為空白組、生地組、一曬熟地組、九曬熟地組、媽富隆組，每組6只，灌胃給予4.5 g/kg蒸餾水、不同炮制程度地黃、12.2 g/kg媽富隆，每天1次，共30 d。

2.2.3 動情周期觀察 給藥期間，每日早晨8點(diǎn)對小鼠進(jìn)行陰道涂片檢查[5]，顯微鏡觀察脫落細(xì)胞形態(tài)，判斷小鼠所處動情周期階段。

2.2.4 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 處死小鼠，分離左側(cè)卵巢，置于福爾馬林溶液中固定48 h，經(jīng)脫水、包埋、切制5 μm石蠟切片(連續(xù)切片)后進(jìn)行常規(guī)HE染色，在顯微鏡下觀察每個卵巢樣本第5片切片的卵泡形態(tài)，對竇前卵泡、竇狀卵泡進(jìn)行計(jì)數(shù)，拍照。

2.2.5 卵巢組織促卵泡生成素受體(FSHR)表達(dá)檢測 小鼠左側(cè)卵巢組織石蠟切片經(jīng)脫蠟后，按照相關(guān)說明書采用免疫組織化學(xué)法檢測FSHR表達(dá)。

2.3 寒熱藥性相關(guān)成分分析

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱定對照品5-羥甲基糠醛2 mg、毛蕊花糖苷0.5 mg，40%甲醇定容于2 mL量瓶中，各移取1 mL于5 mL量瓶中，40%甲醇稀釋并定容至刻度，即得。

2.3.2 供試品溶液制備 取生地、熟地飲片剪碎，精密稱取1.000 g至平底燒瓶中，加入40%甲醇20.00 mL冷浸24 h，濾過，收集濾液，移取10.00 mL至10 mL量瓶中，即得。

2.3.3 地黃HPLC指紋圖譜建立 色譜條件為Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-水(含0.02%甲酸)(B)，梯度洗脫(0～10 min，0%～0.1%A；10～20 min，0.1%～0.5%A；20～25 min，0.5%～1%A；25～30 min，1%～2%A；30～40 min，2%～7%A；40～60 min，7%～15%A；60～70 min，15%～21%A；70～80 min，21%～30%A)；體積流量1 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長284 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.3.4 多元統(tǒng)計(jì)分析 將不同炮制程度地黃HPLC指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1.0多元統(tǒng)計(jì)分析軟件，進(jìn)行偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，分析VIP得分>1的成分，比較其在不同炮制程度地黃中的變化。

3 結(jié)果

3.1 不同炮制程度地黃對小鼠動情周期的影響 陰道涂片結(jié)果見圖1A。如圖1B所示，給藥前各組小鼠動情周期無明顯變化(P>0.05)。如圖1C所示，給藥后與空白組比較，九曬熟地對小鼠動情周期無明顯變化(P>0.05)，而生地、媽富隆有所延長(P<0.01)；與九曬組比較，生地、媽富隆可延長小鼠動情周期(P<0.01)。

3.2 不同炮制程度地黃對卵泡形態(tài)及數(shù)量的影響 卵巢HE染色結(jié)果(×200)見圖2A。如圖2B所示，各組閉鎖卵泡與空白組比較無明顯變化(P>0.05)；而九曬組閉鎖卵泡較生地組、媽富隆組減少(P<0.01)。如圖2C所示，九曬組竇前卵泡較空白組增加(P<0.05)。如圖2D所示，九曬組較生地組和空白組竇狀卵泡增加(P<0.05，P<0.01)。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與九曬熟地組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 不同炮制程度地黃對卵巢組織FSHR表達(dá)的影響 如圖3所示，九曬組FSHR表達(dá)較生地組、一曬熟地組、媽富隆組增加(P<0.01)；九曬熟地組、一曬熟地組、媽富隆組FSHR表達(dá)較空白組增加(P<0.01)。

3.4 寒熱藥性相關(guān)成分分析 3種炮制程度地黃在205、284 nm波長處，共標(biāo)定9個共有峰，見圖4。在用于分析九曬熟地與生地之間成分差異的OPLS-DA模型中，R2X=0.990，R2Y=0.996，Q2=0.993；在用于分析九曬熟地與一曬熟地之間成分差異的OPLS-DA模型中，R2X=0.845，R2Y=0.981，Q2=0.973。九曬熟地聚為一類，生地聚為一類(圖5A)；1～4號峰的VIP得分>1(圖5B)；一曬熟地聚為一類，九曬熟地聚為一類(圖5C)；1～4、6號峰VIP得分>1(圖5D)。另外，1～4號峰峰面積隨炮制程度加深增加，6號峰隨炮制程度加深峰面積減少，見圖6。

注：A～B中RRR為生地，SDPRR1為一曬熟地，SDPRR9為九曬熟地；C、D分別為284 nm、205 nm下對照品；E為40%甲醇的HPLC譜圖。

圖5 多元統(tǒng)計(jì)分析

圖6 地黃HPLC共有峰峰面積變化

4 討論

卵巢是女性主要的生殖器官，為水火之臟，卵子的順利發(fā)育、排出與腎中陰陽的順利轉(zhuǎn)化有關(guān)[6-7]。動情周期是雌性哺乳動物性成熟后，生殖器官發(fā)生增生退化的周期性變化，動情周期延長或停滯提示排卵受影響[8]，本研究中，生地延長小鼠動情周期，而一曬熟地、九曬熟地對小鼠動情周期無影響，說明熟地性溫，入腎經(jīng)能夠順應(yīng)腎中陰陽轉(zhuǎn)化，使卵子順利排出，而生地性寒，入腎經(jīng)不利腎中陰陽轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致排卵推遲。

卵巢中卵泡在排卵前的發(fā)育需經(jīng)歷竇前卵泡、竇狀卵泡等的一系列過程，F(xiàn)SHR在卵泡的發(fā)育過程中有重要作用，F(xiàn)SHR與其配體促卵泡生成素(FSH)結(jié)合，可以激活多種酶促反應(yīng)，促進(jìn)卵巢中性激素的合成，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育[9]。高表達(dá)FSHR的卵泡，在卵泡募集、選擇的階段，即使在FSH水平低的情況下，亦能利用低水平FSH，促進(jìn)卵泡的發(fā)育，而低表達(dá)FSHR的卵泡則不能順利發(fā)育，最終趨于閉鎖[10]。本實(shí)驗(yàn)中，九曬熟地較空白組增加小鼠卵巢竇前卵泡、竇狀卵泡的數(shù)量，而生地、一曬熟地與空白組比較對竇前卵泡、竇狀卵泡無影響，且九曬熟地較生地組竇狀卵泡數(shù)量增加，可能是由于九曬熟地性溫，補(bǔ)腎填精而夠促進(jìn)卵泡發(fā)育，而生地性寒，一曬熟地的溫?zé)崴幮圆患熬艜袷斓兀饰幢憩F(xiàn)出促進(jìn)卵泡發(fā)育的作用，說明地黃的寒熱藥性會影響地黃對卵巢排卵的作用。九曬熟地組小鼠卵巢組織FSHR表達(dá)高于空白組、生地組、一曬熟地組小鼠，提示FSHR可能是九曬熟地促進(jìn)排卵的靶點(diǎn)之一。

炮制改變中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)，為探究九曬熟地中區(qū)別于生地、一曬熟地的溫性成分，本研究采用了色譜法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法。該方法是利用降維的思想，根據(jù)化合物的色譜信息，選取與化合物最相關(guān)的特征來參與分類，能夠最大程度簡化具有眾多復(fù)雜化學(xué)變量的樣本[11]。結(jié)果顯示1～4號峰、6號峰為九曬熟地區(qū)別于生地、一曬熟地的主要差異成分。1～4號峰其隨炮制程度加深而增加，在九曬熟地中含量最高，可能為九曬熟地中的溫性成分，其中1號峰為5-羥甲基糠醛。5-羥甲基糠醛是由糖類、氨基酸在炮制過程中經(jīng)美拉德反應(yīng)生成的化合物，如黨參[12]、女貞子[13]等藥材經(jīng)過炮制后5-羥甲基糠醛含量增加，其被認(rèn)為可能是引起這些中藥炮制前后寒熱藥性發(fā)生改變的成分之一。

綜上所述，不同炮制程度地黃寒熱藥性不同，對卵泡發(fā)育的影響不同，九曬熟地性溫，能促進(jìn)卵泡發(fā)育，F(xiàn)SHR為其作用靶點(diǎn)之一，5-羥甲基糠醛可能為九曬熟地區(qū)別于生地、一曬熟地的溫性成分之一。