白 雯 白澤坤 陳未希 吳景華

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 河北唐山 063000

原發(fā)性肝癌簡稱肝癌，是發(fā)生于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是人類最常見的惡性腫瘤之一，其中70%～85%為肝細(xì)胞癌(HCC)[1]。盡管目前治療肝癌的手段眾多，但其死亡率仍在腫瘤相關(guān)致死率中居第二位[2]。肝癌組織惡性程度較高，治療方法復(fù)雜、易轉(zhuǎn)移、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜都是導(dǎo)致肝癌致死率高的因素[3-4]。早期肝癌起病隱匿，診出率較低，大多數(shù)患者確診時已處于晚期，也是導(dǎo)致肝癌患者遠(yuǎn)期預(yù)后差、5年生存率低的重要原因。因此,探討肝癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥機(jī)制對于提高患者預(yù)后具有重要價值[5]。

1 表觀遺傳學(xué)的概述

表觀遺傳學(xué)是指在不發(fā)生DNA序列改變前提下，通過DNA甲基化、非編碼RNA活性改變、組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)、RNA甲基化等方式使基因表達(dá)發(fā)生可遺傳的改變[6]。表觀遺傳學(xué)是近年來新興的熱門研究領(lǐng)域，目前表觀遺傳學(xué)的改變已被證實(shí)在多種代謝性疾病及惡性腫瘤疾病的發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要的作用[7-8]。由于表觀遺傳學(xué)的改變往往在惡性腫瘤的早期就已經(jīng)發(fā)生，因此，深入探索表觀遺傳調(diào)控的分子機(jī)制,分析其與肝癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移及耐藥的關(guān)系，將有助于發(fā)現(xiàn)新的早期肝癌腫瘤標(biāo)記物，有助于完善和豐富早期肝癌的診斷方法，為實(shí)現(xiàn)肝癌靶向藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)，改善肝癌患者的預(yù)后。

2 N6-腺嘌呤甲基化(m6A)修飾的概述

近年來，隨著甲基化RNA免疫沉淀技術(shù)(MeRIP)、甲基化RNA免疫沉淀測序(MeRIP-Seq)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)和高通量測序等技術(shù)的不斷發(fā)展，人們可以更準(zhǔn)確、快速、靈敏的發(fā)現(xiàn)和鑒定RNA甲基化修飾位點(diǎn)和分布[9]。RNA的甲基化主要的包括N1-腺嘌呤甲基化(m1A)、m6A、3-胞嘧啶甲基化(m3C)、5-胞嘧啶甲基化(m5C)、N7-鳥嘌呤甲基化(m7G)以及RNA核糖2'-O-甲基化(Nm)。其中m6A占RNA甲基化修飾的80%以上[10-11]。

m6A的修飾因子包括三種類型：書寫器(writer)也稱為甲基轉(zhuǎn)移酶，是一個主要由METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、RBM15和ZC3H13組合而成的復(fù)合體,其主要功能是催化RNA甲基化過程；擦除器(eraser)也被稱為去甲基化酶，如ALKBH5和FTO，可以逆轉(zhuǎn)已經(jīng)形成的甲基化修飾；閱讀器(reader)是甲基化識別蛋白，主要為RNA結(jié)合蛋白的YTH結(jié)構(gòu)域(YTHDF1，YTHDF2和YTHDF3)，其主要作用是結(jié)合選擇性的m6A，從而影響RNA剪接、定位、翻譯和穩(wěn)定性[12-13]。m6A修飾可以被甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶同時調(diào)控，是一個動態(tài)可逆的過程。m6A甲基化修飾在多種癌癥中均有報道，目前已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中如結(jié)直腸癌、肝癌及代謝相關(guān)性疾病中具有特定功能和分子機(jī)制。

鑒于HCC在世界范圍內(nèi)的高發(fā)病率和死亡率，為提高早期診出率、降低致死率，闡明其發(fā)生和進(jìn)展的機(jī)制尤為關(guān)鍵。m6A作為新興的研究重點(diǎn)，在加深我們對HCC進(jìn)展機(jī)制的理解上至關(guān)重要。因此，在這篇綜述中，我們總結(jié)了m6A和HCC相關(guān)研究的最新進(jìn)展，包括肝癌發(fā)生和進(jìn)展機(jī)制及肝癌的耐藥機(jī)制。

3 m6A修飾在肝癌中的研究進(jìn)展

N6-甲基腺嘌呤核苷是RNA甲基化修飾中最為普遍的一種，m6A修飾在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中都具有重要作用。Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白(WTAP)是m6A甲基化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Chen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，WTAP在肝癌組織中高表達(dá)且WTAP高表達(dá)的患者預(yù)后差，同時WTAP也是肝癌預(yù)后的獨(dú)立危險因素。Chen等通過MeRIP、雙熒光素酶報告基因測定以及染色質(zhì)免疫沉淀等方法證實(shí)WTAP介導(dǎo)的m6A修飾通過HuR-ETS1-p21 / p27軸來調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的G2/M期，促進(jìn)HCC的進(jìn)展。KIAA1429也是m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶的主要組成部分之一，其在肝癌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)且與預(yù)后相關(guān)[15]。Lan等[16]發(fā)現(xiàn) KIAA1429可誘導(dǎo)GATA3 pre-mRNA3'UTR上的m6A甲基化，導(dǎo)致RNA結(jié)合蛋白HuR的分離和GATA3 pre-mRNA的降解，從而提出了一個基于m6A修飾的KIAA1429-GATA3調(diào)控模型，揭示了肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中轉(zhuǎn)錄組異常調(diào)控的機(jī)制。Cheng課題組[17]也通過RNA干擾及MeRIP-PCR等方法明確了KIAA1429可通過上調(diào)ID2 mRNA的m6A修飾水平抑制ID2的表達(dá)，以此增強(qiáng)肝癌的遷移和侵襲能力，證明了甲基轉(zhuǎn)移酶KIAA1429的升高可以促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。Zuo等[18]的實(shí)驗(yàn)證明，m6A修飾可以通過穩(wěn)定LINC00958的RNA轉(zhuǎn)錄使其上調(diào)，從而影響肝癌的預(yù)后。

Qiao等[19]通過研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾與肝癌的血管生成擬態(tài)(VM)形成密切相關(guān)，可以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。Li課題組發(fā)現(xiàn)[20]肥胖相關(guān)蛋白(FTO)在肝癌組織中高表達(dá)，且高表達(dá)的患者遠(yuǎn)期生存率低，并且發(fā)現(xiàn)HCC組織中總RNA的m6A相對含量低于正常組織，表明FTO異位表達(dá)提示肝癌患者預(yù)后較差，并與肝癌中較低的m6A含量相關(guān)。FTO使ALKBH5在肝癌中被下調(diào)，而ALKBH5表達(dá)降低是肝癌患者生存率降低的獨(dú)立預(yù)后因素。Chen等[21]研究證明，ALKBH5在體外和體內(nèi)均具有抑制HCC細(xì)胞增殖和侵襲能力，他們通過Dot Blot、MeRIP-qPCR方法證實(shí)ALKBH5在肝癌細(xì)胞中通過m6A依賴的方式減弱LYPD1的表達(dá)以抑制肝癌的發(fā)生。通過以上研究我們可以發(fā)現(xiàn)，去甲基化酶的升高或降低均可以影響肝癌的進(jìn)展及預(yù)后，且去甲基化酶之間也存在相互作用，這提示我們影響肝癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的機(jī)制復(fù)雜，并不是由單一因子調(diào)控，而是由多種調(diào)控蛋白共同作用。

Zhao等[22]發(fā)現(xiàn)m6A“閱讀器”YTHDF1的增加與肝癌患者預(yù)后不良有關(guān)，YTHDF1在調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞代謝和細(xì)胞周期進(jìn)程中起著重要的作用。Hou等[23]通過MeRIP、LC-MS/MS等試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在HCC中，YTHDF2的減少可促進(jìn)腫瘤炎癥的進(jìn)展、血管的重塑和轉(zhuǎn)移。YTHDF2可通過降解發(fā)生m6A修飾導(dǎo)致穩(wěn)定性發(fā)生改變的IL11和SERPINE2 mRNA來抑制腫瘤細(xì)胞和腫瘤脈管系統(tǒng)的遷移。同樣Zhong和他的團(tuán)隊[24]也發(fā)現(xiàn)，在HCC中細(xì)胞的缺氧可以誘導(dǎo)YTHDF2的下調(diào)，并且YTHDF2的過表達(dá)可以抑制HCC中肝癌細(xì)胞的增殖、腫瘤生長以及MEK和ERK信號通路的激活。YTHDF2直接結(jié)合EGFR 3'-UTR的m6A修飾位點(diǎn)，以促進(jìn)HCC細(xì)胞中EGFR mRNA的降解，從而抑制細(xì)胞增殖和生長。這些發(fā)現(xiàn)加深了我們對肝癌中m6A甲基化修飾的理解，為肝癌的靶向治療提供了理論依據(jù)。

綜上所述，m6A修飾在肝癌發(fā)生和發(fā)展過程中是一把雙刃劍，通過甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的雙重調(diào)節(jié)使RNA甲基化修飾成為一個動態(tài)可逆的過程，m6A修飾水平升高或降低，可以通過改變RNA穩(wěn)定性等方法，影響其剪接、翻譯從而調(diào)控肝癌的發(fā)生和進(jìn)展。因此想要將m6A及其調(diào)控蛋白作為肝癌的診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)，還需更深入研究其在肝癌中的具體作用機(jī)制。

4 m6A修飾與肝癌的耐藥機(jī)制

盡管治療肝癌的手段眾多，但其死亡率仍在腫瘤相關(guān)致死率中居第二位，其3年生存率僅為12.7%，中位生存期為9個月[25]。大多數(shù)肝癌患者就診時已處于晚期階段，失去了手術(shù)治療機(jī)會，需依靠化學(xué)藥物治療，但癌細(xì)胞的耐藥性也是導(dǎo)致肝癌患者預(yù)后差、生存期短的一個重要原因。隋守光等[26]的研究表明，miRNA-433過表達(dá)可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對多西他賽的敏感性。多項(xiàng)研究也證實(shí)，RNA相關(guān)的表觀遺傳學(xué)改變與結(jié)腸癌、胰腺癌等消化道腫瘤的耐藥機(jī)制密切相關(guān)[27]。酪氨酸激酶抑制劑索拉非尼是當(dāng)前公認(rèn)的最常見用于晚期HCC的一線藥物，可顯著改善無法進(jìn)行手術(shù)治療的肝癌患者的總體生存率。但在實(shí)際臨床治療中，索拉非尼治療晚期肝癌患者的療效欠佳，僅能將晚期肝癌患者的平均生存期延長3個月左右，而耐藥性是導(dǎo)致肝癌對索拉非尼不敏感的一個重要原因[28]。2020年Lin 等[29]的研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基化修飾在耐索拉非尼的肝癌細(xì)胞中被顯著下調(diào)。并通過MeRIP-Seq分析，確定FOXO3是METTL3介導(dǎo)的m6A甲基化修飾的關(guān)鍵下游靶標(biāo)。在小鼠異種移植模型中發(fā)現(xiàn)，METTL3的降低通過抑制其介導(dǎo)的FOXO3 mRNA的穩(wěn)定性而顯著增強(qiáng)肝癌對索拉非尼耐藥性，而過表達(dá)FOXO3可恢復(fù)m6A依賴性的索拉非尼敏感性。因此靶向m6A修飾的潛在調(diào)節(jié)因子，可以改善對索拉非尼耐藥的肝癌的治療效果，為肝癌的藥物治療提供了一種新的方法。

目前關(guān)于m6A修飾與肝癌耐藥性的研究尚不完善，治療效果更有待臨床驗(yàn)證。為了研發(fā)出更多靶向作用m6A調(diào)節(jié)蛋白的制劑，還需要我們進(jìn)一步探索m6A修飾與肝癌耐藥機(jī)制的關(guān)系，以期為肝癌的化學(xué)藥物治療提供新策略，延長肝癌晚期患者的生存期，改善治療效果。

5 小結(jié)及展望

肝癌的發(fā)生是病毒感染、免疫機(jī)制、遺傳背景以及環(huán)境等多重因素共同作用的結(jié)果。目前肝癌的早期診斷主要依靠血清甲胎蛋白(AFP)檢測和影像學(xué)檢查，由于血清AFP特異性不高及影像學(xué)檢查的局限性，導(dǎo)致早期肝癌診出率欠佳，大多數(shù)患者就診時往往已處于晚期。且肝臟腫瘤生長速度快、易于轉(zhuǎn)移和侵襲、缺乏有效的治療手段也是導(dǎo)致大部分患者預(yù)后差、5年生存率低的主要原因。因此，提高早期肝癌的診斷效率，促進(jìn)肝癌靶向治療藥物的研發(fā)是我們今后研究的主要方向。上述因子在肝癌組織中均有差異表達(dá)，且通過各種不同的途徑對m6A修飾水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而不同程度上影響肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥及預(yù)后，表明了m6A甲基化修飾及其相關(guān)因子在肝癌的診斷、惡性程度的判斷和預(yù)后方面具有一定的潛力。目前針對m6A修飾在肝癌中具體作用機(jī)制的研究還處于初期階段，尚無研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基化修飾在早期肝癌中的變化程度，因此未來想要將其應(yīng)用到早期肝癌的診斷中，還需明確m6A甲基化在早期肝癌中的具體變化水平，并可與血清AFP進(jìn)行聯(lián)合診斷，以改善單一血清AFP在早期肝癌診斷中效能欠佳的現(xiàn)狀，提高早期肝癌的診斷效率。目前手術(shù)切除、經(jīng)肝動脈栓塞化療(TACE)和化學(xué)藥物仍是治療肝癌的主要手段。但手術(shù)治療創(chuàng)傷大、恢復(fù)慢，TACE治療不徹底、易復(fù)發(fā)等都是導(dǎo)致治療效果不佳的主要原因。m6A及其調(diào)節(jié)因子與肝癌進(jìn)展及耐藥性的關(guān)系為針對這些因子研發(fā)出靶向治療藥物，提高肝癌患者的治療療效提供了理論依據(jù)。近年來甲基化檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，越來越多的研究聚焦于RNA甲基化修飾。隨著對肝癌發(fā)病機(jī)制的更進(jìn)一步研究以及檢查和治療手段的完善，m6A修飾及其調(diào)控蛋白有望成為肝癌診斷、治療及預(yù)后判斷的新靶標(biāo)。