國(guó)超 曾繁爽 楊旭 吳洋磊 楊禎

摘 要：綜述了caspase種類(lèi)、分類(lèi)和caspase家族在機(jī)體發(fā)育、炎癥和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮的重要作用。總結(jié)了不同種類(lèi)的caspase在魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)、甲殼類(lèi)和棘皮類(lèi)中的免疫應(yīng)答、作用機(jī)制以及炎癥中的階段性研究進(jìn)展，并歸納了caspase抑制劑在水產(chǎn)動(dòng)物中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：caspase; caspase抑制劑;水產(chǎn)動(dòng)物

Caspase是一類(lèi)進(jìn)化保守，具有相似氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和特異性底物的蛋白酶家族[1]。由于caspase具有半胱氨酸蛋白酶活性——其活性位點(diǎn)的半胱氨酸殘基僅在天冬氨酸殘基之后才會(huì)親核攻擊和切割目標(biāo)蛋白，因此caspase被稱(chēng)為具有天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，又稱(chēng)為半胱天冬酶[2]。目前已鑒定出14種半胱天冬酶，分別命名為caspase-1—caspase-14，它們都具有一些共同的特性：（1）均為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶;（2）都有一個(gè)保守的五肽活性位點(diǎn)QACXG（X可以是R、Q或D）;（3）前體都是稱(chēng)為前蛋白酶的酵素[3]。根據(jù)半胱天冬酶在氨基酸序列上的同源性，將半胱天冬酶分為三個(gè)亞類(lèi)，第一類(lèi)是被稱(chēng)為細(xì)胞凋亡活化劑的啟動(dòng)caspase，包括caspase-2、caspase-8、caspase-9、caspase-10;第二類(lèi)是被稱(chēng)為細(xì)胞凋亡效應(yīng)劑的效應(yīng)caspase，包括caspase-3、caspase-6和caspase-7;第三類(lèi)是發(fā)揮炎癥介質(zhì)作用的caspse，例如caspase-1、caspase-4、caspase-5等[4]。一般情況下，半胱天冬酶家族可通過(guò)兩條途徑被激活：一是凋亡信號(hào)誘導(dǎo)的凋亡受體介導(dǎo)途徑;另一種是應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體介導(dǎo)途徑（caspase-9依賴(lài)途徑）。一旦凋亡途徑被激活，它們就會(huì)產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，凋亡激活因子caspase-2、caspase-8等將激活其下游凋亡效應(yīng)因子caspase-3、caspase-6和caspase-7。

半胱天冬酶在生物程序性細(xì)胞死亡（例如細(xì)胞焦亡和壞死性凋亡）中發(fā)揮重要作用，而這些形式的細(xì)胞死亡可以保護(hù)生物體免受應(yīng)激信號(hào)刺激和病原體攻擊。同時(shí)半胱天冬酶在炎癥中也有作用，它可以直接處理促炎細(xì)胞因子，如pro-IL1β。由于以上半胱天冬酶在細(xì)胞凋亡和免疫中發(fā)揮的不可或缺的作用，越來(lái)越多有關(guān)水產(chǎn)動(dòng)物半胱天冬酶的研究被報(bào)道，因此，本文將綜述近年來(lái)半胱天冬酶在魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)、甲殼類(lèi)和棘皮類(lèi)四大類(lèi)水產(chǎn)動(dòng)物中的研究進(jìn)展，以期為研究者了解半胱天冬酶對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞凋亡和免疫的影響提供參考。

1 Caspase在魚(yú)類(lèi)中的研究進(jìn)展

細(xì)胞凋亡對(duì)所有多細(xì)胞生物的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)具有重要的影響。因此，所有后生動(dòng)物物種似乎都擁有凋亡機(jī)制的必要組成部分，但總的來(lái)說(shuō)，它們的數(shù)量和復(fù)雜性在進(jìn)化過(guò)程中不斷增加。幾乎所有哺乳動(dòng)物半胱天蛋白酶的同源魚(yú)類(lèi)已被鑒定出來(lái)，但也有一些魚(yú)類(lèi)特有的半胱天蛋白酶被認(rèn)為具有不同的功能[5]。

斑馬魚(yú)（Danio rerio）作為常見(jiàn)的模式生物是研究caspase最全面的魚(yú)類(lèi)之一。斑馬魚(yú)的基因組編碼多種凋亡成分，包含多個(gè)caspase啟動(dòng)子和效應(yīng)子，其中至少有6個(gè)caspase具有與哺乳動(dòng)物caspase-8和caspase-10同源的蛋白酶結(jié)構(gòu)域[6]。同時(shí)在斑馬魚(yú)中還發(fā)現(xiàn)了幾種炎性介質(zhì)的caspase：caspase caspy和caspase caspy2，其催化結(jié)構(gòu)域與人caspase-1和caspase-5的同源性最高，但它們都包含一個(gè)n端pyrin結(jié)構(gòu)域[7]。此外，斑馬魚(yú)的基因組包含caspase-C和一種caspase-C樣蛋白酶，與人類(lèi)caspase-4的相似性很高[8]。

關(guān)于caspase的研究報(bào)道在其他常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)中屢見(jiàn)不鮮。LPEZ-CASTEJN等[9]首次鑒定魚(yú)類(lèi)炎癥性caspase—金頭鯛（Sparus aurata）caspase-1，并發(fā)現(xiàn)鯛魚(yú)caspase-1基因在孵化后1天的幼魚(yú)中表達(dá)，其mRNA表達(dá)水平在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都在增加。大西洋鮭作為一種原始硬骨魚(yú)，其凋亡受體和線粒體介導(dǎo)途徑的許多關(guān)鍵成分被鑒定出來(lái)，Takle等[10]從大西洋鮭中克隆了五種編碼caspase-3、caspase-6和caspase-7的基因，并在熱應(yīng)激鮭魚(yú)胚胎中研究發(fā)現(xiàn)，高溫可以誘導(dǎo)啟動(dòng)子caspase激活。Bi等[11]鑒定小黃魚(yú)的caspase-6和caspase-7基因，并分析了整個(gè)caspase家族的進(jìn)化，進(jìn)一步描述了魚(yú)類(lèi)中caspase-6和caspase-7基因的進(jìn)化選擇位點(diǎn)。結(jié)果表明，caspase-6基因在硬骨魚(yú)的物種進(jìn)化和基因復(fù)制方面的出現(xiàn)，早于caspase-7，且caspase-6基因在魚(yú)類(lèi)進(jìn)化過(guò)程中沒(méi)有潛在的正選擇位點(diǎn)，而caspase-7基因則被發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)潛在的正選擇位點(diǎn)。除此之外，其他常見(jiàn)的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的部分caspase研究進(jìn)展見(jiàn)表1。

2 Caspase在貝類(lèi)和甲殼類(lèi)中的研究進(jìn)展

相比魚(yú)類(lèi)，caspase在貝類(lèi)和甲殼類(lèi)中的研究較少，主要集中于牡蠣、扇貝、貽貝、鮑、對(duì)蝦和部分蟹類(lèi)。在貝類(lèi)和甲殼類(lèi)的caspase的研究中，主要方法有：（1）從轉(zhuǎn)錄水平上探究caspase基因在各組織的表達(dá)。（2）通過(guò)脅迫等方式激發(fā)免疫應(yīng)答，探究該物種caspase基因?qū)γ{迫的響應(yīng)。

研究表明caspase基因廣泛存在于貝類(lèi)和甲殼類(lèi)的血細(xì)胞、鰓和肝胰腺等組織，例如在太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）鰓中觀察到較高的caspase-3和caspase-7表達(dá)水平[23]，牡蠣先天免疫反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)鰓和血細(xì)胞中caspase-1表達(dá)量較高[24]，香港牡蠣（Crassostrea hongkongensis）體內(nèi)caspase-8中普遍表達(dá)，其在性腺和外套膜中表達(dá)水平最高[25];雜色鮑（Haliotis diversicolor）[26]和皺紋盤(pán)鮑（Haliotis discus discus）[27]caspase基因在鰓、血液、肝胰腺和肌肉等各組織器官中均有表達(dá)，其中在鰓中表達(dá)量最高，可能是因?yàn)轹w是病原菌入侵的主要部位;caspase基因在中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）[28]和凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）[29]血細(xì)胞、心臟、肝胰腺、鰓、胃、肌肉等組織中廣泛表達(dá)，其中中華絨螯蟹肝胰腺中表達(dá)量最高而凡納濱對(duì)蝦血細(xì)胞中表達(dá)量最高。

3 Caspase在棘皮類(lèi)中的研究進(jìn)展

Caspase在棘皮類(lèi)中的研究主要集中于海膽和海參。海膽作為常見(jiàn)的模式生物通常用來(lái)研究caspase在動(dòng)物細(xì)胞凋亡和免疫中發(fā)揮的作用。由于目前已成功鑒別的海膽caspase基因僅數(shù)種，包括caspase-3、caspase-7、caspase-8[30]，因此有關(guān)海膽caspase實(shí)驗(yàn)大多數(shù)是研究在一種或數(shù)種環(huán)境脅迫下海膽體內(nèi)整個(gè)caspase酶家族的變化，這些變化可以用caspase酶活力、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)、細(xì)胞凋亡數(shù)量等評(píng)估。

與海膽不同，海參caspase的研究通常與海參特有的生理習(xí)性（例如化皮、吐腸、夏眠、再生等）相聯(lián)系，其中與化皮關(guān)聯(lián)的海參caspase基因研究是最多的，這與海參化皮伴隨細(xì)胞凋亡、凋亡信號(hào)傳導(dǎo)等凋亡過(guò)程有關(guān)[31]。已有研究表明，海參自溶過(guò)程中caspase-3、caspase-9是關(guān)鍵性的內(nèi)源酶之一[32]。

4 Caspase抑制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用

細(xì)胞凋亡是一種在受到適當(dāng)觸發(fā)因素刺激時(shí)允許細(xì)胞自我毀滅的機(jī)制，細(xì)胞凋亡可以調(diào)節(jié)機(jī)體發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，但凋亡的失衡會(huì)引起機(jī)體發(fā)生疾病，例如腫瘤的產(chǎn)生、自身免疫疾病、細(xì)胞過(guò)度凋亡和凋亡衰減等。由于caspase家族是介導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞凋亡關(guān)鍵性的內(nèi)源酶，因此caspase抑制劑也被廣泛應(yīng)用于治療機(jī)體的凋亡失衡。Caspase抑制劑主要分為兩類(lèi)：（1）天然caspase抑制劑，例如細(xì)胞因子效應(yīng)調(diào)節(jié)劑A（CrmA）、Zn2+等;（2）人工合成caspase抑制劑，包括合成肽類(lèi)和合成非肽類(lèi)。

隨著水產(chǎn)動(dòng)物caspase研究的深入，研究表明caspase抑制劑可用于治療水產(chǎn)動(dòng)物凋亡失衡，提高抗病能力。例如KIM等[33]發(fā)現(xiàn)廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK可以延長(zhǎng)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)感染病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV）的存活時(shí)間;YABU等[34]發(fā)現(xiàn)caspase抑制劑benzyloxycarbonyl-Asp-Glu-Val-Asp-fluoromethylketone可以明顯抑制斑馬魚(yú)因caspase-3的過(guò)表達(dá)而引起的細(xì)胞凋亡;Qu等[35]發(fā)現(xiàn)凋亡抑制劑（IAP）蛋白可以通過(guò)抑制牡蠣（Crassostrea gigas）caspase活性和促進(jìn)免疫反應(yīng)來(lái)維持細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡之間的平衡;宋林生等[36]克隆了一種中華絨螯蟹caspase抑制劑基因EsCystatin并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)體外重組表達(dá)，研究結(jié)果表明當(dāng)重組蛋白濃度達(dá)到350 μg/mg時(shí)木瓜蛋白酶（活性中心為半胱氨酸）活性被完全抑制，研究結(jié)果為中華絨螯蟹病害防治和防御體制提供了理論基礎(chǔ);楊靜峰等[37]發(fā)現(xiàn)使用廣譜性caspase抑制劑Z-DEVD-FMK及其多肽衍生物AC-DEVD-CHO以及6-氨基-3-甲基嘌呤，通過(guò)浸泡或者灌腸的方式用于海參，可以抑制因細(xì)胞凋亡而引起的海參化皮，有效延長(zhǎng)鮮活海參的存活和運(yùn)輸時(shí)間。

5 展望

caspase是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性?xún)?nèi)源酶，與機(jī)體的免疫密切相關(guān)。研究caspase在水產(chǎn)動(dòng)物的種類(lèi)和作用，有助于了解和掌握水產(chǎn)動(dòng)物的疾病發(fā)生機(jī)制，從而進(jìn)一步發(fā)掘潛在的免疫增強(qiáng)劑。目前有關(guān)水產(chǎn)動(dòng)物caspase的研究處于起步階段，僅有部分魚(yú)類(lèi)趨近完善，大部分貝類(lèi)、甲殼類(lèi)和棘皮類(lèi)的報(bào)道相對(duì)較少。毋庸置疑，未來(lái)Caspase必將是水產(chǎn)免疫研究的重點(diǎn)對(duì)象。

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（收稿日期：2021-08-16;修回日期：2021-10-29）