牛凍精技術(shù)研究進(jìn)展

馬莉欣，戴雁峰，2

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古福瑞錦牧業(yè)有限公司，呼和浩特 010105）

近年來(lái)，人工授精（Artificial insemination，AI）、體外受精（In vitro fertilization，IVF）等輔助生殖技術(shù)（Assisted reproductive technology，ART）有效地促進(jìn)了畜牧業(yè)的發(fā)展，尤其是在大規(guī)模、集約化和專業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域。

精液冷凍技術(shù)是關(guān)鍵的輔助生殖技術(shù)之一，主要是指人工采精后，利用稀釋液將原精液等溫稀釋，進(jìn)行平衡處理后快速冷凍，并在液氮中長(zhǎng)期保存。目前精液冷凍技術(shù)采用的模式多為顆粒冷凍精液和細(xì)管冷凍精液。隨著體外儲(chǔ)存和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸技術(shù)的顯著提升，精液冷凍技術(shù)通過(guò)遺傳資源的跨區(qū)域交流改善了群體繁殖［1］。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，可以將長(zhǎng)期冷凍保存的牛凍精復(fù)蘇后，檢查處理精子活力，人工輸入發(fā)情母牛生殖道內(nèi)，使其受胎。目前該項(xiàng)技術(shù)是最新的人工授精技術(shù)，能夠長(zhǎng)時(shí)間保存優(yōu)質(zhì)種公牛的精液，不受時(shí)間、地域限制，可最大程度地發(fā)揮出優(yōu)質(zhì)種公牛的繁育能力［2，3］。

但是需要指出的是，在哺乳動(dòng)物精子冷凍保存、復(fù)蘇過(guò)程中，由于活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生不平衡和氧化應(yīng)激增強(qiáng)而導(dǎo)致的冷凍損傷嚴(yán)重降低了精子功能和存活率，從而導(dǎo)致精液質(zhì)量惡化［4］。氧化應(yīng)激主要由ROS的過(guò)度產(chǎn)生或抗氧化能力的降低引起，在冷凍保存過(guò)程中會(huì)降低精子的活力、線粒體活性以及膜通透性，進(jìn)而引發(fā)的DNA鏈斷裂及Ca2+、K+水平增加導(dǎo)致精子活力下降，使其受精能力顯著降低［5-10］。尋找更好的精液冷凍保存系統(tǒng)以提高精液質(zhì)量和最佳妊娠率一直是研究人員和育種者的長(zhǎng)期追求，本文對(duì)當(dāng)前牛精液冷凍技術(shù)進(jìn)行了概述，以期為后續(xù)實(shí)際生產(chǎn)、應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 牛凍精技術(shù)發(fā)展及優(yōu)點(diǎn)

在20世紀(jì)50年代，F(xiàn)raser等［3］首先開(kāi)展了牛冷凍精液技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)的提出符合家畜育種的迫切需要，并且是建立在人工授精發(fā)展的基礎(chǔ)上，作為精液長(zhǎng)期保存的解決方案，牛凍精技術(shù)的實(shí)施使得家畜的繁殖育種和人工授精技術(shù)得到了快速的發(fā)展，也使得全國(guó)養(yǎng)殖場(chǎng)之間的協(xié)作能夠快速、大規(guī)模且有計(jì)劃的開(kāi)展。

與此同時(shí)，在家畜養(yǎng)殖中，牛凍精技術(shù)使得個(gè)體飼養(yǎng)戶及企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益得到極大的提高，家畜養(yǎng)殖若采用自然交配的方式繁衍后代，1頭公牛1年大約只能配種25頭左右的母牛。若采用精液低溫或常溫的保存方式再進(jìn)行人工授精，1頭公牛1年大約能配幾百頭左右的母牛，而利用冷凍方法保存的精液進(jìn)行人工授精，1頭品種優(yōu)質(zhì)的公牛1年能配種幾千甚至上萬(wàn)頭的母牛。

近年來(lái)隨著化工技術(shù)、生物化學(xué)、生理學(xué)、物理學(xué)等學(xué)科的高速發(fā)展，使得牛精液在冷凍、保存、運(yùn)輸方面不僅提供了理論以及技術(shù)上的支持，還使這項(xiàng)技術(shù)得到了快速的發(fā)展。目前，牛凍精輸精技術(shù)可以隨時(shí)隨地開(kāi)展，擺脫了種牛壽命的限制，使得家畜繁殖育種的工作速度和工作質(zhì)量都得到了提高。此外，牛凍精技術(shù)還具有擴(kuò)大配種數(shù)量、提高優(yōu)秀種公牛的有效利用、減少種公牛的飼養(yǎng)、防治疾病、提高受胎率、消滅不孕、遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)戎T多優(yōu)點(diǎn)［11］。

2 不同牛凍精技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

常規(guī)緩慢冷凍（程序化冷凍）和玻璃化冷凍是牛凍精技術(shù)的主要方法。作為最常用的技術(shù)，程序化冷凍以1~2℃/min的降溫速度將精子冷卻至-196℃。這種傳統(tǒng)冷凍方法的缺點(diǎn)主要是在冷凍過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)冰晶的異常產(chǎn)生，其次是由于潛熱耗散不足導(dǎo)致的細(xì)胞機(jī)械性損傷；細(xì)胞內(nèi)冰晶會(huì)破壞細(xì)胞骨架，而細(xì)胞外冰晶會(huì)增加溶質(zhì)濃度和滲透壓，引發(fā)細(xì)胞失水，進(jìn)一步導(dǎo)致精子活力下降。與此同時(shí)，程序化冷凍也導(dǎo)致精子復(fù)蘇后獲能不足的現(xiàn)象［11，12］。

玻璃化冷凍法是先在溫度較低的環(huán)境下把濃度高的冷凍保護(hù)劑凝固，這樣固體形態(tài)變成不太規(guī)則的玻璃化形態(tài)，能夠保存液體分子和離子的正常分布。所以細(xì)胞內(nèi)有玻璃化產(chǎn)生時(shí)，玻璃化冷凍能夠起到保護(hù)細(xì)胞的作用。目前牛精子、卵子和胚胎的冷凍保存技術(shù)發(fā)展迅速，但是并未實(shí)際應(yīng)用到生產(chǎn)中，相關(guān)機(jī)制正在研究中。根據(jù)目前研究結(jié)果，玻璃化冷凍優(yōu)于常規(guī)化冷凍，有希望應(yīng)用至未來(lái)的牛精液凍存中。

3 牛精液凍存、復(fù)蘇過(guò)程中的損傷

牛精液凍存、復(fù)蘇過(guò)程中，代謝途徑、酶和抗氧化劑活性的改變導(dǎo)致精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的破壞，降低了精子壽命和受精能力，主要的損傷誘因有如下幾點(diǎn)。

3.1 滲透脅迫

低溫保存引發(fā)的冷卻壓力改變精子內(nèi)的滲透壓［13］，最終導(dǎo)致冷凍精液質(zhì)量下降。精子體積小，表面積大，凍存導(dǎo)致其黏度在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度中發(fā)生轉(zhuǎn)變，促進(jìn)細(xì)胞外冰晶的形成［14］。冰晶的形成增加了精子外溶質(zhì)濃度（如糖、鹽和蛋白質(zhì)），進(jìn)而改變了細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞脫水［15］。研究報(bào)道指出，凍存中精子的脫水程度與溫度下降程度呈負(fù)相關(guān)［16］，雖然溫度下降速率增大，細(xì)胞內(nèi)脫水程度降低，但是溫度下降速率過(guò)高時(shí)，精子內(nèi)細(xì)胞冰晶的產(chǎn)生水平增強(qiáng)，引發(fā)了對(duì)細(xì)胞膜和其他細(xì)胞內(nèi)成分的物理?yè)p傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［17］。

3.2 氧化應(yīng)激

在冷凍保存過(guò)程中，線粒體膜流動(dòng)性和精子膜磷脂結(jié)構(gòu)的變化均會(huì)導(dǎo)致精子內(nèi)ROS的生成，從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，破壞精子內(nèi)的碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)及功能［18］。

3.3 生物物理和超結(jié)構(gòu)變化

富含多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA）的牛精子質(zhì)膜由于極易發(fā)生過(guò)氧化，是冷凍保存過(guò)程中受損的主要部位［19］。凍存操作引發(fā)的異常脂質(zhì)過(guò)氧化、冰晶形成和滲透梯度會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞膜的不可逆損傷。冷凍和復(fù)蘇過(guò)程中的溫度和滲透效應(yīng)導(dǎo)致的精子含水量改變使精子暴露于高鹽濃度下，該過(guò)程產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力導(dǎo)致了質(zhì)膜的不對(duì)稱性。

與此同時(shí)，降溫過(guò)程也會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞膜磷脂橫向運(yùn)動(dòng)受限，引發(fā)脂質(zhì)聚集及蛋白質(zhì)的不可逆聚集，從而改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)［20］。此外，精子頭部質(zhì)膜結(jié)構(gòu)重組和磷脂運(yùn)動(dòng)受限與冷凍導(dǎo)致的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺外化密切相關(guān)［21，22］。精子頭部質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)重組破壞了公牛精子與雌性生殖道中的卵母細(xì)胞正常融合的能力。

此外，降溫過(guò)程也會(huì)導(dǎo)致精子內(nèi)細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)損傷，使得復(fù)蘇后的精子容易出現(xiàn)大體形態(tài)缺陷、頂體異常、線粒體活性降低、ATP生成減少等問(wèn)題，而且細(xì)胞完整性、活力、運(yùn)動(dòng)性和受精能力也大幅度下降［23，24］。

3.4 分子改變

凍存過(guò)程中，滲透性和溫度的變化導(dǎo)致精子脂質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重組，從而降低了精子的受精潛能。與此同時(shí)，凍存對(duì)細(xì)胞的表觀遺傳因素如DNA甲基化和組蛋白修飾也有顯著調(diào)控作用，凍存、復(fù)蘇等操作顯著改變了精子的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征和復(fù)雜生理學(xué)，也可導(dǎo)致非編碼RNA表達(dá)模式的改變，進(jìn)而基于基因轉(zhuǎn)錄、蛋白修飾水平引發(fā)細(xì)胞凋亡。

冷卻應(yīng)力、細(xì)胞收縮、氧化應(yīng)激、滲透壓變化和DNA修復(fù)酶的異常也可能導(dǎo)致細(xì)胞核DNA的不穩(wěn)定性，在牛精液冷凍中具體表現(xiàn)為染色質(zhì)松弛、DNA斷裂及碎片化，從而導(dǎo)致父系遺傳信息的不準(zhǔn)確傳遞，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致胚胎植入受損及妊娠失敗。

3.5 細(xì)胞凋亡

凍存可觸發(fā)精子的凋亡，在人類、豬及牛的凍存精子中可以檢測(cè)到膜磷脂酰絲氨酸易位，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡，具體表現(xiàn)為線粒體膜電位降低、半胱天冬酶激活、細(xì)胞體積減少、DNA斷裂和膜通透性增加［25］。

3.6 代謝改變

凍融損傷改變了機(jī)體的能量來(lái)源和生理功能，精子細(xì)胞需要來(lái)自稀釋液的持續(xù)能量供應(yīng)，并且隨著運(yùn)動(dòng)能力的增強(qiáng)，這種需求顯著增加。營(yíng)養(yǎng)素在細(xì)胞內(nèi)代謝，通過(guò)糖酵解、檸檬酸循環(huán)和氧化磷酸化產(chǎn)生富含能量的ATP，但該過(guò)程受到各種冷卻壓力的阻滯，由于糖酵解過(guò)程的臨界性，凍存后精子內(nèi)的ATP濃度降低，AMP/ADP轉(zhuǎn)化率增加，損害了精子的基本功能［26，27］。

4 提高牛凍精改良受胎率的關(guān)鍵技術(shù)措施

4.1 做好發(fā)情鑒定

在牛凍精輸精前，應(yīng)該做好受體的發(fā)情鑒定，避免輸精后個(gè)體妊娠失敗。

4.1.1 發(fā)情前期發(fā)情前期是母牛發(fā)情的一個(gè)準(zhǔn)備階段。此時(shí)期母牛通常會(huì)有一點(diǎn)煩躁不安的癥狀，并且慕雄。這個(gè)時(shí)期通常持續(xù)3~5 d，其中最為明顯的表現(xiàn)是在母牛的陰道中會(huì)流出較稀且黏的液體，而且陰戶也會(huì)慢慢變大。

4.1.2 發(fā)情高潮發(fā)情高潮是母牛的性欲最為強(qiáng)烈的時(shí)期，這個(gè)時(shí)期是母牛整個(gè)發(fā)情階段生理變化最為明顯的時(shí)候，在此時(shí)期母牛會(huì)有激動(dòng)、情緒不安、經(jīng)常發(fā)出叫聲、食欲不振，最明顯的癥狀是陰道部位有透明類似纖維狀的較黏的液體流出，且外陰處有腫脹。這個(gè)時(shí)期通常持續(xù)時(shí)間只有12~18 h。

4.1.3 發(fā)情末期發(fā)情末期時(shí)，母牛的各種表現(xiàn)都發(fā)生了改變，首先陰道部位透明類似纖維狀的較黏的液體分泌量減少，顏色逐漸加深，最后變成乳白色。情緒方面也不再有興奮不安的狀態(tài)，逐漸平靜，外陰處的腫脹也逐漸消失。

4.1.4 休情期這時(shí)母牛的性欲已經(jīng)消失，這個(gè)時(shí)期通常持續(xù)時(shí)間能夠達(dá)到10~14 d。

4.2 輸精判斷

4.2.1 準(zhǔn)確掌握輸精時(shí)間授精操作人員可以利用直腸檢查法來(lái)判斷母牛卵泡的發(fā)育情況準(zhǔn)確掌握輸精時(shí)間，摸卵泡時(shí)能夠感受到波動(dòng)感，卵泡具有脆弱感時(shí)即可說(shuō)明此時(shí)卵泡發(fā)育狀態(tài)適合輸精。

通常情況下，母牛的發(fā)情時(shí)間大概是4~18 h，發(fā)情之后就是排卵的時(shí)間，即在發(fā)情后的10~12 h，大概是在發(fā)情末期外陰處的腫脹也逐漸消失癥狀出現(xiàn)之后。對(duì)于不同年齡的母牛配種時(shí)間也要有所調(diào)整。通常情況下，年齡較大身體素質(zhì)相對(duì)較差的母牛發(fā)情時(shí)間較短，而且排卵的時(shí)間相對(duì)又早，要盡量把配種時(shí)間提前。年輕體壯的母牛發(fā)情時(shí)間較長(zhǎng)，而且排卵時(shí)間相對(duì)又晚，要盡量把配種時(shí)間延后。

4.2.2 準(zhǔn)確掌握輸精部位由于母牛最適合輸精的部位是子宮體，所以通常人工授精時(shí)就將精液輸入該部位。假如輸精的時(shí)間相對(duì)較晚，可將精液輸在具有排卵功能卵巢側(cè)的子宮角內(nèi)。

4.3 人工授精技術(shù)

4.3.1 輸精器械及操作人員的準(zhǔn)備

4.3.2 發(fā)情牛保定與消毒把適合輸精的母牛放入配種專用的保定架里，之后再由工作人員將其尾巴用栓尾繩拴住并且系在高處或直接拉住母牛尾巴。此時(shí)其他工作人員先用干凈的溫度適宜的水清洗該母牛外陰部位，再將外陰處消毒，消毒可用酒精棉球輕輕擦洗或使用0.1%的高錳酸鉀溶液清洗。

4.3.3 精液細(xì)管裝槍將解凍后的精液取出，用消過(guò)毒的棉布將細(xì)管外部的液滴擦掉，再用消過(guò)毒的剪刀將封口剪掉，剪刀應(yīng)距封口頂端1.3 cm左右，之后把具棉塞一端裝進(jìn)輸精槍中，注意要平行裝入。剪口一端要和輸精外套管緊密連接，以防精液回流至輸精外套管里面，在此過(guò)程中，務(wù)必避免任何可能對(duì)母牛的生殖道造成污染的操作。

4.3.4 輸精輸精時(shí)通常采用直腸把握輸精法，在此過(guò)程中，注意避免空氣進(jìn)入直腸引起直腸膨脹，導(dǎo)致受體不適的情況。同時(shí)，在輸精器接近子宮頸外口時(shí)，用把握子宮頸的手向陰道方向牽拉子宮頸，使其接近輸精器前端，避免輸精器損傷子宮頸。在輸精過(guò)程中，輸精器前進(jìn)方向、回抽、擺動(dòng)、滾動(dòng)等需要靈活掌握，避免受體不適造成輸精失敗。

輸精操作結(jié)束后應(yīng)做好記錄，記錄要及時(shí)、詳細(xì)，如牛編號(hào)、胎次、上次產(chǎn)犢時(shí)間、發(fā)情時(shí)間、配種時(shí)間、配種次數(shù)、精液用量、配種人員、公牛精液等信息。

5 結(jié)語(yǔ)

在廣大基層地區(qū)積極推廣凍精改良技術(shù)，是牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)不斷向前發(fā)展的重要舉措。積極推廣牛凍精改良技術(shù)，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種公牛精液的快速普及，快速覆蓋，提高優(yōu)質(zhì)種公牛的利用效率，降低養(yǎng)殖場(chǎng)購(gòu)買種公牛的經(jīng)濟(jì)成本。對(duì)于養(yǎng)殖規(guī)模較大的養(yǎng)殖場(chǎng)和養(yǎng)殖戶，應(yīng)用該項(xiàng)改良技術(shù)具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益，能有效增加繁殖母牛的受胎率，及時(shí)發(fā)現(xiàn)不健康的種公牛精液，避免繁殖系統(tǒng)疾病的傳播蔓延。