一例奶牛乳房炎病例病原菌分離及鑒定

宋淑英

（遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，沈陽 110164）

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖過程中的常發(fā)疾病之一，臨床表現(xiàn)為乳房腫脹、炎癥區(qū)域溫度升高、乳區(qū)泌乳障礙、分泌乳汁呈血乳及渾濁。該病發(fā)展至后期可導(dǎo)致奶牛死亡，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［1-3］。病原菌微生物感染是造成奶牛乳房炎的主要原因，目前已知有超過180 種病原微生物能夠引起奶牛乳房炎［4，5］。本研究對遼寧撫順某奶牛養(yǎng)殖場1例乳房炎陽性病例進(jìn)行病原菌分離、鑒定，為該場確定乳房炎病因、制定合理的治療及防控措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病例情況 乳房炎陽性病牛臨床表現(xiàn)為2 個乳區(qū)明顯腫脹、泌乳機(jī)能障礙、疼痛感較為明顯、泌乳為血乳并伴有乳汁凝塊，乳區(qū)溫度高。

1.1.2 試驗儀器 10 mL 離心管、培養(yǎng)皿、酒精燈、各量程微量移液器（Eppendorf）、恒溫隔水式培養(yǎng)箱（SDK-9685）、無菌潔凈工作臺（SJ-6093）、玻璃棒等均由撫順市動物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.3 主要試劑 營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基、普通固體瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甘露醇氯化鈉培養(yǎng)基、改良愛德華培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管、葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定管，杭州微生物試劑有限公司；鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管，杭州濱河微生物試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 將病牛隔離保定，使用乙醇、碘酊對患病乳區(qū)進(jìn)行3 次消毒。棄去頭3 把奶后，擠5～8 mL 乳樣于滅菌的離心管中。將離心管密封標(biāo)記后，于4 ℃冰盒內(nèi)盡快送至實驗室進(jìn)行病原分離。

1.2.2 培養(yǎng)基制備 分別取適量的麥康凱瓊脂粉、甘露醇氯化鈉瓊脂粉和改良愛德華瓊脂粉，溶于1 000 mL去離子水中，高壓滅菌后制備固體培養(yǎng)基。制備改良愛德華培養(yǎng)基時，需在液體培養(yǎng)基溫度達(dá)到39～45 ℃時快速加入5 mL 5%脫纖維兔血，并迅速搖勻［6］。上述固體培養(yǎng)基需在潔凈工作臺中制作且需滿足一定厚度。培養(yǎng)基制作完成后，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜檢菌。檢菌合格的培養(yǎng)基可用于病原分離試驗。

1.2.3 病原菌初步分離 用微量移液器取病料乳樣100 μL，注入3 mL 的無菌肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min 恒溫培養(yǎng)箱振蕩過夜，使病原菌整體擴(kuò)增。分別取100 μL 擴(kuò)增后的培養(yǎng)液，均勻涂布于檢菌合格的麥康凱平板、甘露醇氯化鈉平板以及改良愛德華平板，用三角玻璃棒將菌液涂抹均勻，于無菌工作臺中正置3～5 min，待菌液完全吸收后將其倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)8～12 h 后觀察［7，8］。將疑似分離株于固體瓊脂平板中進(jìn)行單獨(dú)菌落分離，并保存于30%甘油中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病原菌生化反應(yīng)鑒定 在潔凈工作臺對初步分離的大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌疑似分離株進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定。將初步分離的病原菌分離株甘油溶液進(jìn)行復(fù)蘇，在肉湯擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂平板涂布。在無菌工作臺中，將微量生化反應(yīng)管于上端1/3處掰斷，反應(yīng)液面與反應(yīng)管斷端預(yù)留出足夠空間。用無菌接種針將瓊脂平板中的單獨(dú)菌落分別接種于對應(yīng)的生化反應(yīng)鑒定管中。將鑒定管封口編號后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。之后觀察反應(yīng)管顏色變化并根據(jù)編碼手冊進(jìn)行編碼，最終確定分離株種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌初步分離結(jié)果

病料經(jīng)初步分離，麥康凱瓊脂平板中選取的圓形、金屬紅色光澤菌落被判定為大腸桿菌疑似株，甘露醇氯化鈉瓊脂平板中選取的黃色菌落且菌落周圍為黃色被判定為葡萄球菌疑似株，5%脫纖維兔血改良愛德華瓊脂平板中選取的具有β溶血環(huán)的乳白色針尖狀小菌落被判定為鏈球菌疑似株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2個患病乳區(qū)采集到的乳樣中，共初步分離到7 株大腸桿菌疑似分離株、13 株葡萄球菌疑似分離株及5株鏈球菌疑似分離株。

2.2 病原菌生化反應(yīng)鑒定結(jié)果

對初步分離的疑似菌株分別進(jìn)行相應(yīng)的生化反應(yīng)管鑒定，觀察記錄結(jié)果并根據(jù)顏色反應(yīng)與相應(yīng)的編碼手冊進(jìn)行賦碼對比最終確定病原菌種類。結(jié)果表明，7株疑似大腸桿菌分離株中5株為大腸桿菌、2株未定型；13株葡萄球菌疑似分離株中，5株為金黃色葡萄球菌、2 株為表皮葡萄球菌、4 株為腐生葡萄球菌、2 株未定型；5 株疑似鏈球菌分離株中，1株為乳房炎鏈球菌、1 株為停乳鏈球菌、2 株為無乳鏈球菌、1株未定型。

3 小結(jié)與討論

奶牛乳房炎發(fā)病率高、流行范圍廣，是制約乳產(chǎn)業(yè)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。其發(fā)病原因眾多，飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)水平、遺傳品種等出現(xiàn)問題均可造成該病發(fā)生。病原菌感染是其最主要的發(fā)病原因之一，細(xì)菌、病毒、霉形體、支原體等超過180種病原微生物均能夠引起奶牛乳房炎［9］。

引起奶牛乳房炎的眾多病原微生物中，細(xì)菌是最為常見也是分離率最高的病原微生物，其中以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌為主。本研究對撫順某牛場1例奶牛乳房炎陽性病例進(jìn)行病原菌分離、鑒定，最終確定5株大腸桿菌、5株金黃色葡萄球菌、4 株腐生葡萄球菌、2 株表皮葡萄球菌、2 株無乳鏈球菌、1 株停乳鏈球菌及1 株乳房炎鏈球菌，這7種病原菌的分離率分別為25.0%、25.0%、20.0%、10.0%、10.0%、5.0%、5.0%。

不同地區(qū)、不同飼養(yǎng)條件下病原的組成不盡相同。孜來古麗等［2］報道新疆地區(qū)奶牛乳房炎主要是由無乳鏈球菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌共同感染造成。陳婷婷等［3］報道甘肅部分地區(qū)奶牛乳房炎主要病原菌為金黃色葡萄球菌，其分離率為39.3%。胡海燕等［4］報道天津某奶牛飼養(yǎng)場奶牛乳房炎主要致病菌為芽孢桿菌，其占比高達(dá)67.28%，其次為腸桿菌屬；張艷等［5］對黑龍江地區(qū)進(jìn)行乳房炎致病菌調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其主要致病菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、蠟樣芽胞桿菌，其分離率分別為26.8%、13.5%、7.2%、3.3%。朱寧等［6］報道上海地區(qū)奶牛乳房炎主要病原分別為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌及糞腸球菌，其分離率分別為16.9%、15.5%、11.3%、7.0%。王浩先等［7］報道安達(dá)地區(qū)奶牛乳房炎病原菌金黃色葡萄球菌分離率約為20.0%。李傲寒等［8］報道在新疆某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場中，乳房炎病原菌組成主要為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，其分離率分別為32%、2%；張博熙等［9］對黑龍江地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場調(diào)查結(jié)果表明，該地區(qū)奶牛乳房炎主要病原菌為無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、腸球菌及少量的金黃色葡萄球菌，其分離率分別為33.5%、27.1%、10.3%及2.3%；夏穎等［10］對河北地區(qū)奶牛乳房炎調(diào)查發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌混合感染為28.7%、金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌混合感染為14%、無乳鏈球菌與綠膿桿菌混合感染為11.3%。吳利軍等［11］對湖北地區(qū)奶牛乳房炎病原菌調(diào)查發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌、中型無綠藻、魯氏不動桿菌、大腸桿菌和停乳鏈球菌的感染率分別為35.0%、13.5%、11.9%、5.1%、2.9%。

本試驗結(jié)果與上述報道中的數(shù)據(jù)相比，在病原菌種類、優(yōu)勢菌株占比等均存在差異，這可能與飼養(yǎng)環(huán)境及地理位置有關(guān)。由于不同地區(qū)主要流行菌株不同，造成各個地區(qū)乳房炎致病菌組成出現(xiàn)差異，因此飼養(yǎng)管理和治療方案也會不同。本研究鑒定結(jié)果可為該廠奶牛乳房炎治療方案合理制定提供參考。