葛 琨，何致峰，林佳娜，胡玉玲，李攻科

（中山大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275）

近年來，由食品接觸材料（Food contact materials，F(xiàn)CMs）引起的食品安全問題受到了廣泛關(guān)注[1－2]。作為FCMs的重要污染物，多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）由于危害大、難降解等特征亟需發(fā)展快速分析方法[3－4]。目前，常用的PAHs分析方法包括液相色譜法[5－6]、氣相色譜－質(zhì)譜法[7－8]等，但這些方法所需儀器昂貴，分析過程繁瑣，無法滿足現(xiàn)場檢測和快速篩查的需求。表面增強拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）快速、靈敏，具有分子指紋特征，非常適用于FCMs中污染物的快速篩查[9－10]，目前已經(jīng)應(yīng)用于多氯聯(lián)苯[11]、鄰苯二甲酸酯類[12－13]、酚類化合物[14－16]、農(nóng)獸藥[17－18]、染料[19－21]等多種污染物的檢測。

但是，結(jié)構(gòu)類似化合物的SERS指紋圖譜信息往往存在譜峰重疊的問題。為了解決該問題，本課題組建立了薄層色譜結(jié)合SERS檢測食品接觸材料中芳香伯胺的分析方法，得到了較好的結(jié)果[22]。另外，也有一些學(xué)者利用適配體的特異性識別作用檢測環(huán)境中的污染物[23－25]，提高選擇性。借助數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)實現(xiàn)食品接觸材料中污染物的快速篩查和污染物鑒別是另一種重要途徑，其中，主成分分析（Principal component analysis，PCA）作為數(shù)據(jù)挖掘的有利工具已經(jīng)被廣泛采用[26－27]。PCA可以對大數(shù)據(jù)進行降維處理，從而快速提取數(shù)據(jù)中的有用信息并進行分類。目前，SERS結(jié)合PCA已經(jīng)被用于多目標物如多種疾病標記物的快速檢測[28－29]，并取得了較好的結(jié)果。

針對食品接觸材料中PAHs種類多、結(jié)構(gòu)類似、拉曼信號弱以及拉曼譜峰重疊的問題，本研究利用碘化鉀（KI）對納米銀溶膠（Ag nanoparticles，AgNPs）的聚沉效應(yīng)獲得高密度熱點，增強PAHs的拉曼信號，并借助數(shù)據(jù)分析軟件SPSS對獲取的拉曼譜峰進行PCA分析，考察了PCA在不同條件下的適用性，從而實現(xiàn)了FCMs中4種PAHs（芘、熒蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽）的快速篩查及鑒定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

i－Raman Plus便攜式拉曼光譜儀（必達泰克光電科技（上海）有限公司），激發(fā)波長為785 nm，光譜測量范圍為150～2 800 cm－1；島津UV－2600紫外－可見分光光度計（日本島津公司）。

硝酸銀（AgNO3）、芘（Pyrene，Pyr）、熒蒽（Fluoranthene，F(xiàn)lA）、苯并[b]熒蒽（Benzo[b]fluorathene，BbF）及苯并[k]熒蒽（Benzo[k]fluorathene，BkF）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水檸檬酸鈉（C6H5Na3O7）購自日本TCI化成工業(yè)有限公司；碘化鉀（KI）購自廣州化學(xué)試劑廠；上述試劑均為分析純，實驗用水為18．25 MΩ·cm的超純水。

1.2 AgNPs的制備

本實驗所用AgNPs采用文獻報道的方法合成[30]：將10．0 mL濃度為10．0 mmol/L的AgNO3加入90．0 mL超純水中并加熱至沸騰，隨后快速加入2．0 mL 10．0 g/L的檸檬酸鈉溶液，沸騰條件下冷凝回流1 h。待冷卻至室溫，獲得的AgNPs經(jīng)0．22μm尼龍濾膜過濾后，避光保存于4℃冰箱備用。

1.3 遷移實驗

將聚對苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）和聚丙烯（Polypropylene，PP）2種餐盒裁剪成1 cm×1 cm尺寸，總表面積為150 cm2，置于0．25 L 95%（體積分數(shù)）乙醇溶液中，于100℃下保持4 h。整個遷移過程需保持恒溫且遷移液不揮發(fā)。最后，將遷移液濃縮20倍備用。

1.4 SERS測試

將50μL KI（2．0 mol/L）與200μL PAHs標準溶液或遷移液加入96孔板中，均勻混合后，加入50μL AgNPs，均勻混合15 min后進行SERS測試。SERS測試條件為：激發(fā)波長：785 nm；掃描波長范圍：200～2 000 cm－1；積分時間：5 s；掃描功率：60 mW。

2 結(jié)果與討論

2.1 SERS測試條件優(yōu)化

由于本文選擇的目標物均屬于多環(huán)芳烴，在結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)上有許多相似之處，因此選擇其中一個目標物可以代表其它目標物。對于溶膠狀SERS增強基底，無機鹽的加入可以有效降低溶膠體系的穩(wěn)定性，從而使納米溶膠發(fā)生團聚而產(chǎn)生高密度的SERS熱點。因此，本文采用無機鹽加入的方法，以0．50 mg/L BbF為目標分子，并記錄BbF在687 cm－1處的拉曼強度，考察了SERS測試條件的影響，包括無機鹽種類、KI濃度、孵育時間以及KI、BbF和AgNPs的混合體積比例，結(jié)果如圖1所示。與其它無機鹽相比，KI對BbF的增強效果最好，其最佳濃度為2．0 mol/L，最佳孵育時間為 15 min，KI（2．0 mol/L）、BbF（0．50 mg/L）、AgNPs（0．2 nmol/L）的最佳混合體積比例為 1∶4∶1。

圖1 BbF的SERS測試條件優(yōu)化Fig．1 Optimization of determination condition for BbF

在優(yōu)化條件下，分別比較了不添加KI與添加KI的BbF的SERS圖，如圖2A所示。在不添加KI的體系中，0．50 mg/L的BbF表現(xiàn)出較差的SERS增強效果；添加KI后，BbF的拉曼信號得到了極大的增強，證明本實驗采用的KI體系可用于PAHs的SERS測試。另外，考察了AgNPs、AgNPs+KI、AgNPs+KI+BbF的紫外－可見吸收光譜（圖2B），從圖中可以看出，AgNPs在418 nm處有明顯的吸收峰，加入KI或KI+BbF后，AgNPs在418 nm處的吸收峰消失，即KI的加入可導(dǎo)致AgNPs聚沉從而提高SERS增強效果。

圖2 BbF在不同增強基底下的SERS譜圖（A）與AgNPs、AgNPs+KI、AgNPs+KI+BbF的紫外－可見吸收光譜（B）Fig．2 SERS spectra of BbF with different substrates（A）and UV－Vis absorption spectra of AgNPs，AgNPs+KI and AgNPs+KI+BbF（B）

2.2 SERS譜峰判定

在最優(yōu)條件下，對4種多環(huán)芳烴進行特征譜峰判定。圖3給出了Pyr、FlA、BbF和BkF的譜峰位置，各譜峰具體振動模式見表1。從圖3和表1可以看出，4種多環(huán)芳烴的拉曼譜峰存在譜峰重疊的現(xiàn)象，例如，Pyr、FlA、BbF和BkF均在1 600 cm－1左右存在苯環(huán)的伸縮振動峰；FlA、BbF和BkF在1 447 cm－1左右存在C—C的伸縮振動峰；BbF和BkF均在1 040 cm－1左右存在C—H的彎曲振動峰等。其共有拉曼位移及振動模式見表2。拉曼譜峰的重疊給實際樣品中PAHs的快速篩查帶來了極大的不便，因此需要有效的數(shù)據(jù)處理方式實現(xiàn)PAHs的快速鑒別。

圖3 4種多環(huán)芳烴的SERS圖譜Fig．3 SERS spectra of 4 PAHs

表1 4種多環(huán)芳烴的拉曼位移及振動模式Table 1 Characteristic Raman peaks and assignment of 4 PAHs

表2 4種多環(huán)芳烴的共有拉曼位移及振動模式Table 2 The overlapping of characteristic Raman peaks and assignment of 4 PAHs

2.3 多環(huán)芳烴的PCA分析

2.3.1 同濃度多環(huán)芳烴的PCA分析為了快速鑒別4種同質(zhì)量濃度的PAHs（0．50 mg/L），使用PCA對獲取的拉曼數(shù)據(jù)進行分析。首先對采集的4種PAHs的SERS譜峰進行編號，根據(jù)拉曼位移的大小排序，每個譜峰對應(yīng)一個編號，如表3所示，4種PAHs共有28個SERS譜峰。將各PAHs的譜峰標出，按照上述同樣的方式進行排序，無特征峰的位置用0代替，獲得4種多環(huán)芳烴相關(guān)譜峰的陣列，將該數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS軟件進行PCA分析。最終，依據(jù)PCA分析結(jié)果得到各次SERS測試的主成分因子得分，導(dǎo)入繪圖軟件后即可觀察結(jié)果。為了保證數(shù)據(jù)的有效性，每種多環(huán)芳烴采集40個SERS光譜信息，共160個SERS光譜信息，滿足樣品數(shù)：變量數(shù)（特征峰數(shù)）＞5的要求。PCA結(jié)果如表4和圖4A所示，從表4中可以看出，160條SERS光譜信息經(jīng)PCA分析后被提取出3個主成分，其中第一、第二、第三主成分的特征值均大于1，且貢獻率分別44．4%、37．1%和18．1%，累計貢獻率為99．6%，因此采用該3個主成分進行得分計算并繪圖。從圖4A中可以看出，4種PAHs經(jīng)PCA分析后可顯著分開，并可判斷出各PAHs的位置。上述結(jié)果表明，采用PCA分析可以對拉曼譜峰重疊的PAHs進行快速鑒定。

圖4 不同PAHs的PCA分析結(jié)果Fig．4 PCA analysis results of different PAHs samples

表3 4種多環(huán)芳烴拉曼位移的編號信息Table 3 Number information of Raman shifts for 4 PAHs

表4 PAHs總方差分析結(jié)果Table 4 Results of total variance analysis for PAHs standards

2.3.2 不同濃度多環(huán)芳烴的PCA分析在復(fù)雜體系樣品中，各個PAHs的濃度很難完全一致，因此考察了PCA對不同濃度PAHs的分離效果。分別采用0．25 mg/L的Pyr，0．75 mg/L的FlA，0．50 mg/L的BbF和1．0 mg/L的BkF進行驗證，實驗步驟與分析過程與同濃度PAHs相同，具體PCA結(jié)果如表4和圖4B所示。從表4中可以看出，160條SERS光譜信息經(jīng)PCA分析后同樣被提取出3個主成分，其中第一、第二、第三主成分的特征值分別為14．1、9．2和4．5，且貢獻率分別50．4%、33．0%和16．0%，累計貢獻率為99．4%，因此該3個主成分被用于主成分得分計算。從圖4B中可以看出，4種不同濃度的PAHs經(jīng)PCA分析后同樣可顯著分開，并可以明顯判斷出4種PAHs的位置。上述結(jié)果表明，采用PCA分析的方式同樣可以對不同濃度的PAHs進行快速鑒定。

2.3.3 多環(huán)芳烴混合樣品的PCA分析復(fù)雜樣品體系中，PAHs可能同時存在，因此針對PAHs混合樣品進行了PCA分析。具體過程為：采集160份PAHs混合樣品的SERS譜圖（圖5），分別對每份樣品SERS譜圖中的各特征峰按照大小順序進行標記，并將160個光譜數(shù)據(jù)分成4份，每份數(shù)據(jù)分別用于Pyr、FlA、BbF和BkF的PCA分析。結(jié)果如表4和圖4C所示，從表4中可以看出，160條拉曼信息經(jīng)PCA分析后提取出3個主成分，特征值分別為12．3、9．9和5．7，貢獻率分別為44．0%、35．2%和20．5%，3個主成分的累計貢獻率為99．7%，按照主成分得分進行繪圖后（圖4C）發(fā)現(xiàn)4種PAHs能較好分開，但占據(jù)空間大，有誤判的風(fēng)險。因此，在PCA分析的基礎(chǔ)上采取最小公差法進一步分析（表4和圖4D），同樣獲得3個主成分，特征值分別為11．9、10．0和6．0，在不改變累計貢獻率的基礎(chǔ)上，第一、第二、第三主成分貢獻率變?yōu)?2．4%、35．9%和21．4%。第一主成分貢獻率下降，第二、第三主成分貢獻率上升，從而可以進一步區(qū)分4種PAHs。從圖4D中可以看出，經(jīng)最小公差法處理后的PAHs被更好地分離。上述結(jié)果表明，PCA分析同樣適用于混合樣品中PAHs的分析。

圖5 一份PAHs混合樣品SERS譜圖Fig．5 SERS spectrum of a mixed PAHs sample

2.4 食品接觸材料中多環(huán)芳烴的PCA分析

最后采用PCA對PET和PP 2種FCMs遷移液中的PAHs進行篩查，圖6A和圖6B分別為PET和PP餐盒遷移液的SERS譜圖。根據(jù)圖3中的SERS譜峰，推測PET餐盒遷移液中可能存在Pyr、FlA，PP餐盒遷移液中存在Pyr、FlA、BkF。分別對PET和PP餐盒遷移液中PAHs的特征峰進行編號，其中PET餐盒共有13個特征峰，PP餐盒共有17個特征峰，因此PET和PP餐盒遷移液共采集90和120條SERS光譜信息。最后，采用“2．3．3”中PAHs混合樣品PCA分析策略進行分析。最終PCA結(jié)果如表5和圖6C、圖6D所示。從表5可以看出，PET餐盒的90條拉曼光譜信息經(jīng)PCA分析后被提取出2個主成分，第一、第二主成分特征值分別為13．8和2．0，貢獻率分別為86．0%和12．4%，2個主成分的累計貢獻率為98．4%。按照主成分得分進行繪圖后（圖6C）發(fā)現(xiàn)Pyr和FlA被較好地分開。同樣，PP餐盒的120條拉曼光譜信息經(jīng)PCA分析后也提取出2個主成分，第一、第二特征值分別為10．3和7．6，貢獻率分別為57．4%和42．1%，2個主成分的累計貢獻率為99．5%。按照主成分得分進行繪圖后（圖6D），發(fā)現(xiàn)Pyr、FlA和BkF同樣被明顯分開。上述結(jié)果表明，PCA分析方法可以解決PAHs的拉曼譜峰重疊問題，適用于FCMs中PAHs的快速鑒別。

圖6 PET遷移液（A）和PP遷移液（B）的SERS譜圖以及PET遷移液（C）和PP遷移液（D）中PAHs的PCA分析結(jié)果Fig．6 SERS spectra of PET migration（A），PP migration（B）and PCA analysis results of PET migration（C）and PP migration（D）

表5 FCMs遷移液總方差分析結(jié)果Table 5 Results of total variance analysis for migrates of FCMs

3 結(jié) 論

本文建立了SERS結(jié)合PCA快速篩查食品接觸材料中4種多環(huán)芳烴（Pyr、FlA、BbF及BkF）的分析方法。利用KI作為絮凝劑使納米銀溶膠聚沉獲得高密度熱點，以實現(xiàn)4種多環(huán)芳烴的表面增強拉曼光譜分析。針對食品接觸材料中Pyr、FlA、BbF、BkF 4種多環(huán)芳烴拉曼譜峰存在重疊難以鑒定的問題，采用PCA法分別對同一濃度、不同濃度4種多環(huán)芳烴以及4種多環(huán)芳烴混合樣品進行分析。結(jié)果表明，4種多環(huán)芳烴均可較好地分離、鑒別。將該方法用于食品接觸材料中4種多環(huán)芳烴的快速篩查及鑒別，取得了較好的效果。該方法的建立對于食品接觸材料中多環(huán)芳烴的快速篩查具有重要意義。