鄭榮兒,吳佳敏,張瑞娟,姬金亮,李雅彬,俞曉平,許益鵬

(中國計量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310018)

褐飛虱Nilaparvatalugens(St?l)(Hemiptera: Delphacidae),是一種在我國和東南亞地區(qū)的農(nóng)業(yè)害蟲之一,以水稻韌皮部為食,爆發(fā)時會對水稻造成巨大的危害,在農(nóng)業(yè)上防治較為困難[1]。目前,基于基因功能的研究,利用RNA干擾等分子生物學(xué)技術(shù)防治褐飛虱已經(jīng)成為一種新興的防治方法[2]。PIGM,編碼糖基磷脂酰肌醇(GPI)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶I,在GPI錨蛋白的生物合成途徑中負(fù)責(zé)將第一個甘露糖從多利醇-磷酸-甘露糖轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)腔側(cè)的前體上,對于GPI錨蛋白的合成具有至關(guān)重要的作用[3]。PIGM亞純啟動子的突變將阻斷GPI的轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致遺傳性糖基磷脂酰肌醇的缺乏,引起靜脈血栓的形成和癲癇的發(fā)作[4]。目前,關(guān)于PIGM的研究都集中在哺乳動物或原生動物中,在昆蟲中未見相關(guān)的報道。我們前期發(fā)現(xiàn),褐飛虱PIGM(NlPIGM)在卵巢中特異性高表達(dá),并通過功能研究證明NlPIGM在褐飛虱的生殖發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用,RNA干擾NlPIGM的表達(dá)會導(dǎo)致褐飛虱雌成蟲卵巢發(fā)育延滯、產(chǎn)卵量下降、胚胎發(fā)育畸形,但其具體的作用機(jī)制不明。因此,進(jìn)一步研究PIGM在褐飛虱中的作用機(jī)制對于利用PIGM作為褐飛虱防治靶標(biāo)有著重要意義。

酵母雙雜交是一種在篩選潛在互作蛋白和研究蛋白之間相互作用方面被廣泛應(yīng)用的生物技術(shù)。Chi等[5]構(gòu)建了煙粉虱Bemisiatabaci的cDNA文庫并從中篩選了54個可能與棉花曲葉病毒外殼蛋白相互作用的候選蛋白;Yu等[6]通過酵母雙雜交證明家蠶BombyxmoriSpz2通過與Toll 11和Toll 9-1相互作用而誘導(dǎo)抗菌肽的表達(dá);Du等[7]通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)中紅側(cè)溝繭蜂Microplitismediator中的GAP1蛋白能夠與棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的RhoA和Cdc42相互作用以抑制宿主的免疫反應(yīng),從而提高寄生成功的可能性;Guo等[8]構(gòu)建了真菌感染后的小麥cDNA文庫,篩選和驗(yàn)證了小麥熱休克蛋白Hsp70與HSF A9L和Hsp90-4存在相互作用,為闡明小麥HSP對真菌感染的反應(yīng)機(jī)制提供了依據(jù)。酵母雙雜交技術(shù)也已廣泛成為研究稻飛虱在植物-宿主互作和病毒-宿主互作等方面的一種技術(shù)[9-11]。如Huang等[10]通過酵母雙雜交系統(tǒng)構(gòu)建的cDNA文庫鑒定了一個與褐飛虱寡霉素敏感相關(guān)蛋白相互作用的水稻齒葉矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10;Qin等[12]則通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)確定了灰飛虱中腸上皮糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白6(ST6)與水稻條紋病毒核衣殼蛋白的相互作用,確定了ST6是水稻條紋病毒跨越中腸感染屏障的關(guān)鍵因子。

本研究通過構(gòu)建褐飛虱cDNA文庫和誘餌載體pGBKT7-NlPIGM,利用酵母雙雜交系統(tǒng)從褐飛虱cDNA文庫中篩選與NlPIGM具有潛在相互作用的蛋白,以進(jìn)一步探究NlPIGM的作用機(jī)制。

1 主要材料與方法

1.1 主要材料

供試褐飛虱長期飼養(yǎng)于中國計量大學(xué)溫網(wǎng)室與人工氣候室中,飼養(yǎng)溫度27 ℃±1 ℃,相對濕度為60%,光周期L∶D=16 h∶8 h,飼養(yǎng)所用水稻品種為TaichungNative1(TN1)。

主要試劑:RNA提取試劑盒(TaKaRa,AK1703)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,AK71648A)、DNA割膠回收試劑盒(TaKaRa,AI51866A)、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ(TaKaRa,AJE1364A)和SalⅠ(TaKaRa,AJ11106A)、T4連接酶(TaKaRa,AI60350A),質(zhì)粒小量提取試劑盒(上海生工生物工程,BB12KA1530)、Trizol(Invitrogen,14105),Oligotex mRNA Midi Kit(Qiagen),JM109大腸桿菌感受態(tài)(TaKaRa,AK51792A)、pMD19T(TaKaRa,K4001AA)、pGBKT7和pGADT7載體以及Y2H Gold酵母菌株保存于本實(shí)驗(yàn)室。

主要儀器:金屬浴鍋(K30,杭州奧盛儀器有限公司)、超凈工作臺(SW-CJ-ZP,浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(HPX-9272-MBE,上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、搖床(ULT2186-4-V49)、PCR儀(T100,Bio-Rad)、凝膠成像儀等(Universal Hood Ⅱ,Bio-Rad)。

1.2 主要方法

1.2.1 褐飛虱總RNA的提取及mRNA的純化

取發(fā)育至3～5日齡的褐飛虱雌成蟲,用0.5 mmol/L的PBS沖洗數(shù)次后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的研缽中,液氮研磨后轉(zhuǎn)移至無RNase的離心管中,使用Trizol法提取褐飛虱的總RNA。隨后,使用Oligotex mRNA Midi Kit對mRNA進(jìn)行分離純化(分離步驟參照試劑盒使用說明書)。然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質(zhì)量,并使用cDNA合成試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 cDNA文庫的構(gòu)建

褐飛虱cDNA初級文庫的構(gòu)建通過CloneMiner cDNA文庫構(gòu)建試劑盒進(jìn)行。合成雙鏈cDNA后,將attB1連接到雙鏈cDNA末端,試劑和實(shí)驗(yàn)方法如下:將10 μL 5× Adapter Buffer,4 μLattB1 Adapter,8 μL 0.1 M DTT,6 μL T4 DNA Ligase混勻,在16 ℃孵育16～24 h;70 ℃,10 h。然后使用柱層析法將cDNA產(chǎn)物分離、沉淀、清洗、溶解后,加入2 μL pDONR222質(zhì)粒,通過BP重組反應(yīng)鏈接載體。

電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B:在重組反應(yīng)液中加入2 μL proteinase K,37 ℃ 15 min,75 ℃ 10 min。加入大腸桿菌DH10B后冰浴10 min,然后轉(zhuǎn)移到電擊杯中電轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化條件:1.5 kV,200 Ω,25 Mf。電轉(zhuǎn)化完成后加入4 mL SOC液體培養(yǎng)基,37 ℃,250 r/min搖床1 h,然后取10 μL菌液,稀釋100倍,取50 μL稀釋后的菌液涂布于Amp抗性的LB培養(yǎng)基上,37 ℃過夜培養(yǎng)后用于計算文庫滴度和庫容量。用LB液體培養(yǎng)基收集其余菌液涂平板所得的菌體,其余菌液涂布于Amp抗性的LB平板,過夜,用使用質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒,得到初級cDNA文庫。

次級cDNA文庫構(gòu)建:將提取到的初級cDNA文庫質(zhì)粒稀釋到300 ng/μL,加入1 μL pGADT7-DEST(300 ng/μL),4 μL LR Clonase,14 μL ddH2O,混勻,25 ℃,孵育16～20 h。然后電轉(zhuǎn)化于DH10B感受態(tài)細(xì)胞,涂布于Amp抗性的LB平板上,鑒定庫容和滴度,提取次級文庫cDNA質(zhì)粒,保存。

次級cDNA文庫轉(zhuǎn)化Y187酵母菌株:簡單來說,就是將5 μL次級文庫cDNA質(zhì)粒,20 μL ssDNA和600 μL Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞混勻,然后使用PEG/LiAC轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞,鑒定庫容和滴度,獲得褐飛虱cDNA文庫。

1.2.3 文庫質(zhì)量和滴度的測定

將轉(zhuǎn)化完成的次級文庫菌液分別稀釋100倍,1 000倍和10 000倍,各取100 μL涂布于SD-Leu平板上,計算菌落生成數(shù)量。文庫滴度的計算方法如下:文庫滴度=單菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/涂布菌液體積(mL)。

原始庫容量(CFU)計算方法如下:CFU=文庫滴度×文庫體積(mL)。

將cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Y187酵母菌株后,取100 μL均勻涂布于Amp抗性的LB培養(yǎng)基上,隨機(jī)挑選24個平板上的單克隆,利用pGADT7通用引物(表1)對其進(jìn)行PCR檢測,計算文庫重組率。重組率計算方法如下:重組率=(陽性插入片段的克隆數(shù)/反應(yīng)總數(shù))×100%。

1.2.4 兩步法構(gòu)建pGBKT7-NlPIGM重組誘餌載體

以設(shè)計的BD-NlPIGM-F/R引物(表1),褐飛虱的cDNA為模板,擴(kuò)增NlPIGM,產(chǎn)物電泳鑒定后回收,與pMD19T進(jìn)行16 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,取200 μL菌液,涂布于Amp抗性的LB平板上,37 ℃過夜培養(yǎng)。次日挑取單個菌落,在含有Amp抗性LB培養(yǎng)基的離心管中培養(yǎng)(37 ℃,180 r/min),取菌液送上海生工生物工程有限公司測序。挑選轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子,抽提質(zhì)粒。將鑒定后的重組質(zhì)粒命名為pMD19T-NlPIGM。然后將pMD19T-NlPIGM質(zhì)粒和pGBKT7空載體分別使用NcoⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切,將割膠回收后的pMD19T-NlPIGM質(zhì)粒的目的片段和pGBKT7質(zhì)粒的載體片段用T4連接酶連接,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)中,挑取轉(zhuǎn)化子搖床振蕩培養(yǎng)(37 ℃,180 r/min),用NcoⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定,測序,鑒定無誤的轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒,命名為pGBKT7-NlPIGM,保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 用于本研究的引物序列

1.2.5 重組誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y2H gold酵母菌株

通過PEG/LiAc轉(zhuǎn)化法,將pGBKT7空載體及pGBKT7-NlPIGM載體分別轉(zhuǎn)化到Y(jié)2H Gold酵母菌株中。先將Y2H Gold在YPDA固體培養(yǎng)基上劃線,于30 ℃培養(yǎng)2～3 d,取1.5 mL離心管,加入1 mL 0.1 mol/L LiAc,挑取單菌落于離心管中重懸,30 ℃,180 r/min振蕩搖床5 min,離心收集菌體。依次加入50% PEG-3350 240 μL,1 mol/L LiAc 36 μL,95 ℃金屬浴5 min,然后冰上放置1 min預(yù)處理的ssDNA 0.1 μg,質(zhì)粒DNA 5 μL,ddH2O 20 μL,漩渦振蕩,42 ℃金屬浴20 min,離心,取上清,加入ddH2O 100 μL。取稀釋10倍,100倍的菌液分別涂布于SD-Trp培養(yǎng)基上,30 ℃封口倒置培養(yǎng)3～5 d,出現(xiàn)單菌落以后,劃線一次,然后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,成功轉(zhuǎn)化的菌株保存于-80 ℃冰箱。

1.2.6 誘餌重組質(zhì)粒的自激活活性及其毒性鑒定

1)重組誘餌質(zhì)粒的自激活活性鑒定:挑選成功轉(zhuǎn)化的重組誘餌菌接種到SD-Trp,SD-trp/X-α-gal,SD-trp/X-α-gal/AbA培養(yǎng)基中,37 ℃封口倒置培養(yǎng)1 d,觀察生長情況,pGBKT7空載體作為對照組。

2)重組誘餌質(zhì)粒的毒性鑒定:將pGBKT7-NlPIGM重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞,取稀釋10倍和100倍的菌液100 μL接種在SD-Trp培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng),觀察其生長情況。轉(zhuǎn)化pGBKT7空載體的菌株作為對照組。

1.2.7 酵母雙雜交篩選潛在互作蛋白

通過mating法篩選雙雜交文庫,將在SD-trp-Leu-His-Ade/X-α-gal/ABA平板上變藍(lán)的雜交克隆送測序,然后通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比對,并分析可能具有相互作用的蛋白功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐飛虱總RNA提取及mRNA電泳驗(yàn)證

從褐飛虱中提取總RNA,測定其RNA OD260/OD280為2.13,電泳檢測發(fā)現(xiàn)28S rRNA和18S rRNA條帶清晰,明亮,亮度比例接近2∶1(圖1A),說明提取的總RNA未發(fā)生降解,完整性較好。mRNA純化后經(jīng)電泳檢測發(fā)現(xiàn)條帶成彌散狀分布,質(zhì)量較高(圖1B)。

注:A—提取的總RNA電泳;B—純化的mRNA電泳;M—DL 2000 Marker圖1 總RNA(A)和純化的mRNA(B)電泳圖Figure 1 Electrophoresis of total RNA(A) and purified mRNA(B)

2.2 cDNA文庫的質(zhì)量和滴度鑒定

將合成的cDNA經(jīng)過BP重組獲得初級cDNA文庫,統(tǒng)計稀釋了100倍的SD-Leu平板上的菌落數(shù)量為1 300,通過文庫滴度計算公式得初級文庫滴度為2.6×107CFU/mL,初級文庫庫容量為1.04×108CFU。平板上挑選的隨機(jī)克隆經(jīng)PCR鑒定,發(fā)現(xiàn)插入片段范圍集中在750～2 000 bp,沒有發(fā)現(xiàn)空載體,計算重組率為100%(圖2A),說明初級cDNA文庫質(zhì)量的完整性和覆蓋性較好。

將初級文庫質(zhì)粒通過LR重組反應(yīng)得到次級文庫,涂布于Amp抗性的平板上,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)稀釋了100倍的平板上克隆數(shù)目為1 700,通過公式計算得到次級文庫的滴度為3.4×107CFU/mL,次級文庫庫容量為1.36×108CFU,在平板上隨機(jī)挑選的24個克隆經(jīng)PCR鑒定后,發(fā)現(xiàn)插入片段范圍集中在750～2 000 bp,沒有發(fā)現(xiàn)空載體,計算重組率為100%(圖2B)。

另外將次級文庫轉(zhuǎn)化Y187酵母菌株,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)稀釋10 000倍的平板有600個克隆,計算文庫滴度為6.0×107CFU/mL。隨機(jī)挑取克隆,PCR檢測后,得到不同大小的條帶,且條帶大小集中于750～2 000 bp附近(圖2C),表明成功構(gòu)建褐飛虱cDNA酵母文庫,且文庫的質(zhì)量較好,可以用于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。

注:A—初級文庫PCR鑒定;B—次級文庫PCR鑒定;C—Y187酵母菌株P(guān)CR鑒定;M—DL 2000 Marker;1～24—隨機(jī)挑選的克隆圖2 cDNA文庫插入片段的電泳檢測圖Figure 2 Electrophoresis identification of inserts in the cDNA library

2.3 誘餌重組載體(pGBKT7-NlPIGM)的鑒定

為了準(zhǔn)確測定那西肽預(yù)混劑中那西肽的含量，參考飼料中那西肽的檢測方法[11]，研究了高效液相色譜-熒光檢測法測定那西肽預(yù)混劑含量的方法，方法操作簡便，靈敏度高，對建立的方法與抗生素微生物檢定法進(jìn)行比較，以期為獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供新的選擇。

將NlPIGM與pGBKT7載體連接,然后用NcoⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶對pGBKT7-NlPIGM載體進(jìn)行雙酶切鑒定,鑒定結(jié)果顯示產(chǎn)物雙酶切后條帶大小與預(yù)期一致(圖3),且測序結(jié)果顯示序列正確,表明成功構(gòu)建了pGBKT7-NlPIGM重組載體。

此外,將誘餌重組載體pGBKT7-NlPIGM轉(zhuǎn)化至Y2H Gold酵母菌株中,涂布,然后通過菌液PCR擴(kuò)增NlPIGM鑒定載體轉(zhuǎn)化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌液PCR條帶明亮、大小與預(yù)期一致(圖4),說明成功構(gòu)建了pGBKT7-NlPIGM誘餌重組載體的Y2H Gold菌株。

注:M1—DL 2000 Marker;M2—DL 10000 Marker;1～2—用于酶切的2個重組載體圖3 重組誘餌載體雙酶切驗(yàn)證圖Figure 3 Verification of recombinant bait vector digested with double restriction enzymes

注:M—DL 2000 Marker;1～5—隨機(jī)挑選的5個克隆圖4 Y2H Gold菌株菌落PCR電泳鑒定圖Figure 4 Colony PCR electrophoresis identification of Y2H Gold strain

2.4 誘餌重組載體的自激活和毒性檢測

將轉(zhuǎn)化了pGBKT7空載體的菌株接種到SD-trp培養(yǎng)基上,將pGBKT7-NlPIGM誘餌重組載體的菌株接種到SD-Trp,SD-trp/X-α-gal,SD-trp/X-α-gal/AbA培養(yǎng)基上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化了pGBKT7空載體的菌株生長狀況良好,轉(zhuǎn)化了pGBKT7-NlPIGM載體的Y2H Gold菌株在SD-Trp和SD-Trp-X-α-gal的培養(yǎng)基中能生長,克隆顏色為白色,生長速度和克隆大小與對照組無明顯區(qū)別,在SD-trp/X-α-gal/AbA培養(yǎng)基中不生長(圖5);另外,轉(zhuǎn)化菌液培養(yǎng)24 h后測定OD600均大于0.8,說明pGBKT7-NlPIGM誘餌重組載體對酵母菌株無毒性和自激活活性,可以用于后續(xù)的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。

2.5 酵母雙雜交陽性克隆鑒定

利用mating法篩選cDNA文庫,將SD-trp-Leu-His-Ade/X-α-gal/ABA平板上變藍(lán)的陽性克隆送測序,然后與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn比對,結(jié)果顯示陽性克隆與數(shù)據(jù)庫序列高度同源(表2)。

注:A—pGBKT7空載體轉(zhuǎn)化Y2H Gold的酵母菌株,SD-Trp培養(yǎng)基;B—pGBKT7-NlPIGM重組載體轉(zhuǎn)化Y2H Gold的酵母菌株,SD-Trp培養(yǎng)基;C—pGBKT7-NlPIGM重組載體轉(zhuǎn)化Y2H Gold的酵母菌株,SD-Trp-X-α-gal培養(yǎng)基圖5 重組誘餌載體自激活和毒性檢測Figure 5 Self-activating activity and toxicity of recombinant bait vector identification

表2 陽性克隆測序結(jié)果比對分析

3 討 論

高質(zhì)量的cDNA文庫和誘餌重組載體的構(gòu)建是成功實(shí)現(xiàn)酵母雙雜交技術(shù)的重要前提。薛進(jìn)等構(gòu)建了白背飛虱的酵母雙雜交cDNA文庫,結(jié)果顯示初級文庫的庫容量為1.72×107CFU,滴度為1.72×106CFU/mL,Y187酵母菌株文庫滴度為5.09×107CFU[13]。肖東來等人構(gòu)建了灰飛虱酵母雙雜交cDNA文庫,檢測表明初級文庫的庫容量為1.85×107CFU,擴(kuò)增文庫的總庫容為1.5×109CFU,文庫滴度為7.7×108CFU/mL[14]。在本研究中,我們所提取的褐飛虱RNA及純化的mRNA質(zhì)量較高,且大部分都分布在100～2 000 bp之間,達(dá)到了文庫構(gòu)建的要求。通過對構(gòu)建的文庫進(jìn)行分析,結(jié)果表明構(gòu)建的初始cDNA文庫庫容量為1.04×108CFU,高于薛進(jìn)和肖東來等人構(gòu)建的文庫庫容,遠(yuǎn)大于1×107CFU的庫容量需求;次級文庫庫容為1.36×108CFU,次級文庫滴度為3.4×107CFU/mL,雖然小于肖東來等人構(gòu)建的文庫滴度,但仍大于3×107CFU/mL的滴度需求。PCR結(jié)果顯示文庫cDNA集中在500～2 000 bp附近,從而保證了文庫具有較廣的覆蓋度及較好的多樣性和轉(zhuǎn)化效果。另外,我們在雙鏈cDNA的末端加上3個不同的接頭,保證了插入的cDNA序列的方向和完整性,提高了cDNA文庫的質(zhì)量和篩選的完整性。

總的來說,本研究通過構(gòu)建高質(zhì)量的褐飛虱cDNA文庫和pGBKT7-NlPIGM重組載體,篩選到了一些與PIGM具有相互作用的蛋白,為探究NlPIGM的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ),但下一步還需要通過RNAi、免疫共定位、免疫共沉淀等手段來進(jìn)一步確認(rèn)NlPIGM與這些蛋白的相互作用。