水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌檢測方法的研究進(jìn)展

彭鐘琴，黃 璐

（廣東茂名農(nóng)林科技職業(yè)學(xué)院，廣東茂名 525000）

淡水和海水的水體中含有多種天然存在的微生物，水產(chǎn)品在捕獲和加工過程中也會(huì)受到污染而攜帶致病菌。魚貝類等水生生物由于體表分泌含有糖蛋白的黏質(zhì)物，使其成為微生物良好的培養(yǎng)基。魚貝類的皮膚和鰓等部位直接與水體接觸會(huì)沾染攜帶水體中的微生物，如弧菌、假單胞菌、黃桿菌和無色桿菌等細(xì)菌，以及甲型肝炎病毒、諾瓦病毒等病毒。當(dāng)魚貝類生物死亡后，附著在體表的微生物會(huì)大量繁殖引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，若水產(chǎn)品被沙門氏菌、葡萄球菌、大腸桿菌、志賀氏菌等污染，還會(huì)引發(fā)多種細(xì)菌性食物中毒。捕獲后的水產(chǎn)品在銷售過程中也會(huì)受微生物污染，如受到漁船的甲板、魚箱、人手、加工廠環(huán)境等污染，被稱為繼發(fā)性污染。因此，水產(chǎn)品的微生物污染與食品安全有著密切的關(guān)系。水產(chǎn)品安全不容忽視，為了較好地控制水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，確保消費(fèi)者的飲食安全，水產(chǎn)品必須經(jīng)過嚴(yán)格的微生物檢驗(yàn)并達(dá)標(biāo)后才能進(jìn)入市場[1]。

1 創(chuàng)傷弧菌生物學(xué)特性

創(chuàng)傷弧菌屬弧菌科弧菌屬，是革蘭氏陰性嗜鹽性弧菌，無芽孢，以極生單鞭毛運(yùn)動(dòng)，菌體大小為（0.5～0.8）μm×（1.4～2.6）μm，彎桿狀。該菌在TCBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，無法進(jìn)行蔗糖的酵解，因而形成菌落著色呈綠色、光滑濕潤、水珠樣，此特性可用作快速鑒別[2]。該菌自然生存于河海交界之處，易感染各種水產(chǎn)動(dòng)物，如魚、蝦、蟹、牡蠣、蛤、蚶及螺等，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的細(xì)菌性病原之一，對(duì)人的感染多通過污染的海產(chǎn)品，引起的食物中毒多發(fā)生在6—10月[3]。創(chuàng)傷弧菌是一種人畜共患病的重要病原菌，危害人類健康，可引起嚴(yán)重的原發(fā)性敗血癥和胃腸炎的疾病，病死率達(dá)50%以上，發(fā)病原因是人們食用了受創(chuàng)傷弧菌感染的海產(chǎn)品，或在捕撈或清洗魚、蝦、蟹、貝類時(shí)受到創(chuàng)傷弧菌的感染[4]。

創(chuàng)傷弧菌對(duì)熱敏感，烹飪過程中可將其殺滅。食用未經(jīng)烹飪的海鮮或海產(chǎn)品加工處理不徹底或因交叉污染海產(chǎn)品被該菌重復(fù)污染，會(huì)使創(chuàng)傷弧菌大量繁殖，引起創(chuàng)傷弧菌食物中毒。

2 創(chuàng)傷弧菌的檢測

創(chuàng)傷弧菌具有高致病性危害，是水產(chǎn)養(yǎng)殖和進(jìn)出口水產(chǎn)品重點(diǎn)檢驗(yàn)檢疫的致病菌。嚴(yán)格開展微生物檢驗(yàn)對(duì)提高食品和水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，保證人體健康、維護(hù)我國的政治信譽(yù)和經(jīng)濟(jì)利益，促進(jìn)對(duì)外貿(mào)易的發(fā)展都具有重要意義。

2020年，國家首次制訂創(chuàng)傷弧菌的國家新標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)》（GB 4789.44—2020），引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。該標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合傳統(tǒng)的生化鑒定和PCR檢測對(duì)水產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行檢測，規(guī)定了對(duì)水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的檢驗(yàn)方法，適用于魚、蝦、蟹、貝類等水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的檢驗(yàn)。此前，國家頒布過兩項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：PCR法和實(shí)時(shí)PCR法。

2.1 常規(guī)分離鑒定

在同樣條件下，用蛋白胨-氯化鈉-纖維二糖-多黏菌素E（PNCC）增菌液作為樣品處理優(yōu)于用3%氯化鈉的堿性蛋白胨水（APW）增菌液。HSU等[5]發(fā)現(xiàn)蛋白胨-氯化鈉-纖維二糖-多黏菌素E（PNCC）增菌液，可抑制溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、副溶血弧菌、大腸埃希氏菌等非目標(biāo)菌的生長，用于創(chuàng)傷弧菌的選擇性增菌培養(yǎng)。樣品增菌后，接種于mCPC瓊脂（改良纖維二糖-多黏菌素B-多黏菌素E）和CC瓊脂（纖維二糖-多黏菌素E）2種選擇性培養(yǎng)基，也可接種于TCBS瓊脂（硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂）、SPS瓊脂（磷酸鹽緩沖液）、CPC瓊脂、VVM瓊脂、VVM瓊脂或VVA瓊脂等選擇培養(yǎng)基，在（36±1）℃條件下培養(yǎng)（18±1）h。TCBS瓊脂培養(yǎng)基最初主要用于分離致病菌，在pH值為8.6的條件下，牛膽汁和NaCl可抑制假單胞菌等非目標(biāo)菌的生長繁殖[6]。

2.2 生理生化鑒定

因創(chuàng)傷弧菌有明顯區(qū)別于其他弧菌的生化特征，可利用生化分析結(jié)果進(jìn)行初步鑒定。創(chuàng)傷弧菌的乳糖、β-半乳糖苷酶陽性，在含8%氯化鈉的蛋白胨水中不生長，而副溶血弧菌和溶藻弧菌的乳糖、β-半乳糖苷酶陰性，在含8%氯化鈉的蛋白胨水中生長。結(jié)合革蘭氏染色鏡檢觀察形態(tài)、氧化酶試驗(yàn)、三糖鐵試驗(yàn)和嗜鹽性試驗(yàn)對(duì)可疑菌落進(jìn)行初步鑒定，然后可選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)做最終確證實(shí)驗(yàn)。目前，可采用API 20E生化鑒定試劑條或微生物鑒定分析系統(tǒng)（美國Biolog）等商業(yè)化產(chǎn)品對(duì)大量樣品進(jìn)行鑒定，不僅可以簡化步驟還能提高鑒定的準(zhǔn)確率。然而，創(chuàng)傷弧菌可能出現(xiàn)較多的非典型菌株，表型多樣，使生理生化鑒定變得更加復(fù)雜。

2.3 免疫生物學(xué)檢測方法

TAMPLIN等[7]以創(chuàng)傷弧菌特異性的單克隆抗體為免疫基礎(chǔ)，建立了檢測創(chuàng)傷弧菌的酶免疫法，檢測限達(dá)2×104CFU/mL，是美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）檢測創(chuàng)傷弧菌的推薦方法之一。PARKER等[8]根據(jù)創(chuàng)傷弧菌分泌至胞外的一種穿孔毒素溶血素（VVH）建立了雙抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法，測定大分子抗原，溶血素（VVH）是創(chuàng)傷弧菌的致病毒力因子之一。ELISA檢測方法是當(dāng)前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的一項(xiàng)新技術(shù)，靈敏度高，無需復(fù)雜儀器且操作簡單，應(yīng)用廣泛。

2.4 常規(guī)PCR檢測方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法。HILL等[9]基于VVHA基因設(shè)計(jì)特異引物首次對(duì)創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行PCR檢測，選用22株非目標(biāo)菌株進(jìn)行了特異性試驗(yàn)，目標(biāo)菌株獲得519 bp的擴(kuò)增條帶，而其他弧菌和非弧菌細(xì)菌無特異擴(kuò)增，檢測限為100 CFU/g。KUMAR等[10]根據(jù)gyrB基因設(shè)計(jì)特異引物對(duì)海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行了PCR檢測，結(jié)果顯示，目標(biāo)菌株都出現(xiàn)一條285 bp的特異性條帶，非目標(biāo)菌株均為陰性結(jié)果。DNA提取前經(jīng)過3%氯化鈉堿性蛋白胨水進(jìn)行18 h增菌處理的樣品，檢出限為30 CFU/g，而不經(jīng)過增菌處理的樣品的檢出限則為300 CFU/g。

2.5 RT-qPCR檢測方法

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)是重要的基因表達(dá)定量方法，具有靈敏度高、靈活度好、實(shí)驗(yàn)門檻低等特點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室最常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。王紫薇等[11]通過RT-PCR法和微生物鑒定藥敏智能系統(tǒng)（VITEK）對(duì)在北京市市場隨機(jī)采集的105份海產(chǎn)品進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)，經(jīng)高度保守的管家基因rpoB基因測序驗(yàn)證，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和微生物鑒定藥敏智能系統(tǒng)方法的準(zhǔn)確率分別為100%和67.5%。

2.6 LAMP技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated Isothermal Am- plification, LAMP）技術(shù)，是一種新的DNA擴(kuò)增方法，LAMP技術(shù)發(fā)展初期主要應(yīng)用于食源性微生物的檢測，目前已出現(xiàn)沙門氏菌（Salmonella）、軍團(tuán)菌（Legionella）、李斯特桿菌（Listeria）和彎曲桿菌（Campylobacter）等微生物的LAMP檢測商品試劑盒。田卓等[12]以創(chuàng)傷弧菌的gyrB基因作為靶基因，優(yōu)化篩選的引物特異地檢測創(chuàng)傷弧菌，檢測核酸濃度的靈敏度可以達(dá)到10-9g/L，在558份水體樣品和655份水產(chǎn)品樣品中，創(chuàng)傷弧菌陽性檢出率分別為0.54%和0.46%，與實(shí)時(shí)熒光PCR方法的檢測結(jié)果符合率為100%。

3 結(jié)語

創(chuàng)傷弧菌是水產(chǎn)品中主要的病原菌之一，近年來，有較多由該菌引起的散發(fā)病例。研究創(chuàng)傷弧菌的檢測方法對(duì)提高食品和水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，保證人體健康具有重要意義。