喬 鑫楊 軍 邊銀丙

（1.武漢商學(xué)院食品科技學(xué)院 湖北·武漢 430056；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌研究所 湖北·武漢 430071）

隨著我國工業(yè)的快速發(fā)展及三廢的大量排放，重金屬污染危及健康的問題受到廣泛關(guān)注。重金屬污染已涉及我國部分食用菌產(chǎn)品，曾經(jīng)發(fā)生一些國家和地區(qū)拒絕進(jìn)口我國被污染的食用菌產(chǎn)品事件[1-4]。食用菌對(duì)有害重金屬有較強(qiáng)的富集能力，而鎘是食用菌中最常見的污染重金屬元素之一，其中，香菇對(duì)鎘的富集能力較強(qiáng)[5-6]。

香菇菌絲能夠分泌天然高分子聚合物，包裹在細(xì)胞壁上形成生命有機(jī)體的重要組成成分，以此來維持生命所必需結(jié)構(gòu)保護(hù)細(xì)胞免受惡劣環(huán)境影響。高分子聚合物主要由分支多糖或其衍生物的長(zhǎng)鏈多糖組成，以葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖為小單位，因此大分子物質(zhì)富含羧基、磷酸基、氨基和羥基等主要官能團(tuán)，這些官能團(tuán)具有很強(qiáng)的重金屬吸附能力，從而能夠絡(luò)合或隔離重金屬，并阻礙重金屬穿過生物膜向細(xì)胞內(nèi)部擴(kuò)散，起到保護(hù)細(xì)胞免受重金屬毒害的作用[7-11]。培養(yǎng)基添加Zn2+是一種有益有效的香菇菌絲抑制重金屬鎘的方法，添加Zn2+不僅促進(jìn)香菇菌絲生長(zhǎng)最快，而且抑制香菇菌絲吸附重金屬鎘[12]。

本研究考察Zn2+添加下，碳源、碳源水平和氮源水平對(duì)香菇菌絲胞外多糖代謝量及其抗鎘能力的影響，分析出Zn2+環(huán)境下香菇菌絲胞外多糖最佳生成條件，為香菇菌絲抑制重金屬鎘探索最佳加工工藝。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試菌株：菌種來源于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種實(shí)驗(yàn)中心，4℃保藏。

cym培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母膏2g，磷酸氫二鉀1.0g，硫酸鎂0.5g，磷酸二氫鉀0.46g，水1L。

1.2 試劑與儀器

鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液購自國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；碘化鉀購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；硝酸、氯化鋅購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羅丹明B、氯化鉀、氯化錳、氯化鎂、氯化鋅、氯化鐵和氯化鈣均購自天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

BXM-30R高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；722可見分光光計(jì)（天津市普瑞斯儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌絲培養(yǎng)

取大小相同菌塊接種于液體培養(yǎng)基中，并置于25℃下120r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)20d。每個(gè)水平3次重復(fù)。

1.3.2 香菇菌絲胞外多糖提取

將去除生物量的培養(yǎng)液，再3000rpm離心10min，取上清液置于小燒杯中，加入3倍體積95%乙醇沉淀24h后，于4800 rpm離心10min，沉淀部分即為胞外粗多糖。最后40℃真空干燥[13]。

1.3.3 鎘含量測(cè)定[14-16]

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確吸取0.10 g/mL、0.12 g/mL、0.14 g/mL、0.16 g/mL、0.18 g/mL、0.2 g/mL 鎘的標(biāo)準(zhǔn)溶液于25mL比色管中，后加入2mL，1mol/L硫酸溶液、7mL碘化鉀（200g/L)溶液，搖勻，靜置2min，再加5mL1%PVA-124溶液，搖勻，沿管壁慢慢加1.5mL 0.05%羅丹明B，靜置1min，再慢慢搖動(dòng)液體，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置5min，用1cm比色皿在620nm波長(zhǎng)處，以試劑空白為參比，測(cè)定吸光度，繪制鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）濕法消解。稱取0.5g香菇菌絲胞外多糖于25ml錐形瓶?jī)?nèi)，放數(shù)顆玻璃珠加10ml混合酸（硝酸：高氯酸（9:1）），加蓋浸泡過夜后，置于電熱板上消解。將消化液裝25ml容量瓶中并定容，同時(shí)做空白試劑。用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）碳源類型。配制含鋅鎘各1mg/L培養(yǎng)基，溶液pH值調(diào)至6，分別加入20 g葡萄糖、20g麥芽浸粉、20g玉米粉三種碳源，于25℃溫度下培養(yǎng)20天，每種碳源重復(fù)3次，考察不同碳源Zn2+對(duì)香菇菌絲胞外多糖在鎘脅迫下的影響。

（2）碳源水平。以最優(yōu)碳源麥芽浸粉為碳源，在含鋅鎘各1 mg/L培養(yǎng)基中分別添加5 g、10 g、15 g、20 g和25 g的麥芽糖，溶液pH值調(diào)至6，于25℃溫度下培養(yǎng)20天，每種碳源水平重復(fù)3次?？疾觳煌荚礉舛?Zn2+對(duì)香菇菌絲胞外多糖在鎘脅迫下的影響。

（3）氮源水平。以麥芽浸粉和蛋白胨作為碳源和氮源，每組添加20g麥芽浸粉，再分別添加不同量的蛋白胨，使氮碳比值分別為0、1:10、1:15、1:20和1:25，即0g、0.8g、1g、1.33g和2g，最后調(diào)制成含鋅鎘各1 mg/L培養(yǎng)基，每種氮碳比重復(fù)3次?？疾觳煌急?Zn2+對(duì)香菇菌絲胞外多糖在鎘脅迫下的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel2013、統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS16.0進(jìn)行整理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1和圖1。

表1：鎘標(biāo)準(zhǔn)液吸光度

圖1：鎘的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由表1和圖1可知，鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線的一元線性回歸方程為y=14.438x+0.0291，相關(guān)系數(shù)R2為0.9995大于0.995，鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線符合要求。

2.2 碳源類型

Zn2+可有效降低香菇菌絲吸附重金屬鎘，碳源的種類是香菇菌絲胞外多糖生成及其吸附抗鎘毒性的重要決定因素，研究Zn2+環(huán)境下不同碳源對(duì)胞外多糖的影響。從圖2可知，不同碳源培養(yǎng)基的代謝產(chǎn)物胞外多糖量和胞外多糖附鎘能力有明顯的區(qū)別，胞外多糖產(chǎn)量多少為麥芽浸粉＞玉米粉＞葡萄糖，胞外多糖附鎘能力大小為麥芽浸粉＞葡萄糖＞玉米粉。其中麥芽浸粉的胞外多糖產(chǎn)量最高，而且胞外多糖附鎘能力最好，所以碳源麥芽浸膏更適合香菇菌絲抵御重金屬鎘對(duì)菌絲內(nèi)部毒害。麥芽浸粉含有豐富淀粉，有利于香菇菌絲生長(zhǎng)發(fā)育和多糖的積累。所以，麥芽浸粉最適合作為香菇菌絲碳源，胞外多糖代謝量多，而且抑制重金屬鎘效果最好。

圖2：不同碳源對(duì)香菇菌絲胞外多糖量和胞外多糖附Cd量的影響

2.3 碳源水平

碳源濃度調(diào)控著香菇菌絲胞外多糖生成量，研究Zn2+環(huán)境下不同碳源濃度對(duì)香菇菌絲胞外多糖產(chǎn)量及抗鎘能力。根據(jù)前期試驗(yàn)，選取麥芽糖為碳源。由圖3可知，胞外多糖產(chǎn)量和胞外多糖附鎘能力均呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。低濃度5 g麥芽糖培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)不充足，導(dǎo)致菌絲生物量和胞外多糖產(chǎn)量受到了限制，香菇菌絲呈現(xiàn)很弱的抗鎘能力。菌絲隨著培養(yǎng)基中麥芽糖濃度的增高，菌絲對(duì)鎘的抗性增強(qiáng)；碳源濃度達(dá)到15g時(shí)，菌絲胞外多糖產(chǎn)量出現(xiàn)快速增長(zhǎng)，相對(duì)于碳源濃度10g時(shí)胞外多糖產(chǎn)量增長(zhǎng)了25.8%；當(dāng)濃度達(dá)到25 g時(shí)，胞外多糖產(chǎn)量最大，且胞外多糖耐鎘能力也最強(qiáng)，但濃度越高胞外多糖產(chǎn)量增長(zhǎng)緩慢，抵抗重金屬鎘的能力卻明顯增強(qiáng)?？傊邼舛鹊奶荚磳?duì)胞外多糖的合成有促進(jìn)作用，濃度達(dá)到一定時(shí)胞外多糖產(chǎn)量受到抑制，但是大量胞外多糖的產(chǎn)生，對(duì)香菇菌絲抵御重金屬鎘能力增強(qiáng)。

圖3：不同麥芽浸粉含量對(duì)香菇菌絲胞外多糖量和胞外多糖附Cd量的影響

2.4 氮源水平

氮源能提供微生物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是合成蛋白質(zhì)和核酸所必不可少的原料，適合的氮源有利于菌體的生長(zhǎng)代謝和胞外多糖合成，Zn2+對(duì)蛋白質(zhì)合成存在影響，研究Zn2+環(huán)境下不同濃度氮源對(duì)香菇菌絲胞外多糖及抗鎘能力影響。由于培養(yǎng)基中酵母膏和蛋白胨里面含有一定的碳源，不僅數(shù)量少，而且不易被細(xì)胞利用，因此計(jì)算氮碳比時(shí)僅將兩者作為氮源，又因?yàn)榈鞍纂烁缓摧^多，所以以蛋白胨作為氮源變量。本實(shí)驗(yàn)選擇20g麥芽浸粉作為碳源，根據(jù)氮碳比確定加入蛋白胨的含量。通過圖4可知，未添加氮源的香菇菌絲代謝胞外多糖和胞外多糖附鎘量低于添加氮源的，說明氮元素是菌絲生物體重要組成成分，能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂增加菌體密度，促進(jìn)糖類物質(zhì)向多糖的轉(zhuǎn)化。隨著氮源濃度的增加，菌絲胞外多糖的代謝量和胞外多糖附鎘量出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，低濃度氮源不足以滿足促進(jìn)胞外多糖生成，高濃度氮源抑制胞外多糖生成，氮源濃度1.33g胞外多糖產(chǎn)量是氮源濃度0.8g的1.13倍，氮源濃度1.33g胞外多糖產(chǎn)量是氮源濃度2g的1.06倍?？傊?，碳氮比20:1，即氮源濃度1.33g，不僅胞外多糖產(chǎn)量高而且抗重金屬鎘最強(qiáng)。

圖4：不同蛋白胨含量對(duì)香菇菌絲胞外多糖量和胞外多糖附Cd量的影響

3 小結(jié)

胞外多糖具有吸附重金屬鎘的能力，Zn2+也是抑制香菇菌絲吸附重金屬鎘重要影響因素。本文主要研究 Zn2+環(huán)境下，香菇菌絲培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分（碳源種類、碳源水平、氮源水平）對(duì)香菇菌絲胞外多糖代謝量和抵抗鎘的效果。

碳源種類對(duì)香菇菌絲胞外多糖代謝抗鎘影響顯著。麥芽浸粉相比玉米粉更易代謝胞外多糖抵抗重金屬，所以最適合碳源為麥芽浸粉。不同的碳源水平對(duì)香菇菌絲胞外多糖代謝有一定影響。高濃度的碳源能夠促進(jìn)胞外多糖的合成，提高菌絲抗鎘毒害。不同的氮源水平對(duì)香菇菌絲胞外多糖合成有影響。碳氮比20:1，即氮源濃度1.33g，不僅胞外多糖產(chǎn)量高而且抗重金屬鎘最強(qiáng)。