BMP1和mTLL1在牙齒發(fā)育中的研究進(jìn)展

胡 菲，謝曉華

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是一個(gè)由蛋白質(zhì)、多糖和水組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，指導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)并影響組織發(fā)育和穩(wěn)態(tài)，其組成和結(jié)構(gòu)的擾亂會(huì)破壞組織發(fā)育和穩(wěn)態(tài)，并促進(jìn)疾病的發(fā)生[1]。BMP1/TLD樣金屬蛋白酶(BMP1/tolloid-like proteinase family，BTP)屬于蝦紅素家族的成員，是細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶小家族[2-3]。在哺乳動(dòng)物中有4種BTP，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(bone morphogenetic protein 1,BMP1)、哺乳動(dòng)物 tolloid(mammalian tolloid，mTLD)、哺乳動(dòng)物tolloid 樣 1(mTLL1)和哺乳動(dòng)物tolloid 樣 2(mammalian tolloid-like 2，mTLL2)[4]。BTP通過加工一些細(xì)胞外基質(zhì)蛋白對(duì)一些組織器官發(fā)育起調(diào)控作用。眾多研究表明，BMP1和mTLL1在牙齒發(fā)育中發(fā)揮重要作用。這兩個(gè)蛋白酶在切割和激活分泌到前期牙本質(zhì)-牙本質(zhì)復(fù)合體和牙周膜的ECM蛋白方面具有共同功能[5]。本文就BMP1和mTLL1的結(jié)構(gòu)、功能及其在牙齒發(fā)育中的研究現(xiàn)狀作一介紹。

1 BMP1和mTLL1的結(jié)構(gòu)及分布

1.1 BMP1和mTLL1的結(jié)構(gòu)

BMP1最初是在能夠異位誘導(dǎo)成骨的骨提取物中鑒定的，然而，與在這些提取物中發(fā)現(xiàn)的其他骨形態(tài)發(fā)生蛋白不同的是，BMP1不是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成員，而是一種鋅依賴性的金屬蛋白酶[6]。Bmp1位于8號(hào)染色體上(8p21.3)[7]。mTLD是由Bmp1編碼的更長(zhǎng)剪接變體，此外，還有兩種在遺傳上不同的哺乳動(dòng)物BTP：mTLL1和mTLL2，分別由Tll1和Tll2編碼[3]。Tll1位于4號(hào)染色體上(4q32.3)[8]。

BMP1和mTLL1具有相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，其中BMP1蛋白酶結(jié)構(gòu)包括氨基末端前結(jié)構(gòu)域、ASTIN樣的金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域以及羧基末端的3個(gè)“complement-uegf-BMP1”(CUB)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(epitheloid growth factor，EGF)樣的結(jié)構(gòu)域，與BMP1不同的是，mTLL1具有5個(gè)CUB結(jié)構(gòu)域和2個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域[3，9]。

1.2 BMP1和mTLL1的分布

BMP1和mTLL1在牙和骨骼等多種組織中共表達(dá)[10]。Bmp1在小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞和牙槽骨表面的成骨細(xì)胞中高表達(dá)，同時(shí)也在牙髓細(xì)胞中表達(dá)；在豬牙蕾的成牙本質(zhì)細(xì)胞和前期牙本質(zhì)中表達(dá)[5，11]。Tll1在小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞、牙槽骨表面的成骨細(xì)胞中表達(dá)，但表達(dá)水平低于Bmp1[5]。上述表明Bmp1在牙本質(zhì)和牙周膜的形成中可能比Tll1發(fā)揮更重要的作用。在小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞、人的修復(fù)性牙本質(zhì)和成牙本質(zhì)細(xì)胞以及豬牙髓-前期牙本質(zhì)-牙本質(zhì)復(fù)合物中檢測(cè)到BMP1蛋白；在小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞中檢測(cè)到mTLL1蛋白[5，11-12]。

2 BMP1和mTLL1的功能

BMP1和mTLL1由兩個(gè)不同的基因編碼，但同屬于一個(gè)結(jié)構(gòu)相似、功能重疊的細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶小家族(BTP)[3]。體外研究表明，該蛋白酶家族的4個(gè)成員在切割和激活細(xì)胞外基質(zhì)蛋白方面具有重疊活性[13-14]。

許多蛋白先以前體形式表達(dá)，然后經(jīng)過蛋白酶的加工轉(zhuǎn)變成有生物活性的蛋白質(zhì)[15]。BTP作為金屬蛋白酶參與此加工過程，主要作用是裂解并激活許多細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在調(diào)節(jié)ECM形成中起重要作用[3]。這些蛋白包括膠原蛋白、富含亮氨酸的小蛋白聚糖、整合素小配體N-連接糖蛋白(small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein，SIBLINGs)、賴氨酰氧化酶、脯氨酰氧化酶、基膜成分、潛在的TGF-β結(jié)合蛋白[4，6]。其中SIBLINGs在牙本質(zhì)中表達(dá)，并具有調(diào)控牙本質(zhì)形成的作用，其5個(gè)家系成員包括骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、基質(zhì)細(xì)胞外磷酸糖蛋白(matrix extracellular phosphoprotein，MEPE)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix protein 1，DMP1)和牙本質(zhì)涎磷酸蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)[16]。另外據(jù)報(bào)道，BTP還能夠激活TGF-β1，從而促進(jìn)ECM的合成[6]。

最新研究結(jié)果顯示Bmp1和Tll1敲除后，心血管組織中還存在尚未確定的代償機(jī)制[17]，BMP1和mTLL1通過使膠質(zhì)球蛋白失活作為一種額外的調(diào)節(jié)機(jī)制來確保周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)朗飛結(jié)正確的時(shí)空組裝[18]。

3 BMP1和mTLL1在牙體組織發(fā)育中的作用

3.1 BMP1和mTLL1促進(jìn)牙本質(zhì)的形成和礦化

牙本質(zhì)發(fā)育不全(dentinogenesis imperfecta，DGI)是一種常染色體顯性遺傳疾病，其特征是牙本質(zhì)礦化不良和牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)改變[19-20]。Syx等[21]報(bào)道的4個(gè)BMP1突變的患者中有2個(gè)表現(xiàn)出典型的DGI癥狀：半透明和脆弱的牙齒，伴有棕色和乳光色，支持BMP1在牙本質(zhì)形成和礦化中起重要作用的觀點(diǎn)。

Wang等[22]通過他莫昔芬誘導(dǎo)組織中普遍存在的Cre表達(dá)使Bmp1和Tll1在小鼠出生后同時(shí)被敲除，結(jié)果顯示該小鼠牙本質(zhì)變薄和礦化缺陷、前期牙本質(zhì)層擴(kuò)大、牙根變短以及牙齒萌出延遲，其中磨牙牙根礦化率的降低程度比牙冠更為嚴(yán)重。另外Zhang等[5]通過構(gòu)建Col1a1-Cre;Bmp1flox/flox;Tll1flox/flox小鼠模型(dcKO小鼠)，使表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白細(xì)胞中的Bmp1和Tll1均失活，導(dǎo)致dcKO小鼠下頜第一磨牙牙根變短、牙本質(zhì)變薄、牙髓腔增大以及牙本質(zhì)小管排列紊亂且數(shù)量少于正常小鼠。綜上所述，BMP1和mTLL1的活性對(duì)于牙本質(zhì)(尤其是根部牙本質(zhì))的形成和礦化至關(guān)重要。

3.2 BMP1和mTLL1影響牙體組織發(fā)育的機(jī)制

牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)由90%的Ⅰ型膠原和10%的非膠原蛋白組成，其中非膠原蛋白DMP1和DSPP在調(diào)控成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和牙本質(zhì)基質(zhì)形成礦化中起重要作用[23-24]。多項(xiàng)研究表明，BTP裂解并激活Ⅰ型膠原蛋白、DMP1和DSPP[4，13，25]。由此可見，BTP對(duì)于牙本質(zhì)形成礦化的重要性。

為闡明BMP1和mTLL1在牙本質(zhì)形成及礦化中的作用機(jī)制，Wang等[22]進(jìn)一步研究。其組織學(xué)分析顯示，BMP1和mTLL1廣泛缺失小鼠的牙髓細(xì)胞增殖減少且成牙本質(zhì)細(xì)胞分化減少以及極化缺失；分子機(jī)制研究表明，膠原蛋白在牙本質(zhì)中蓄積，非膠原蛋白DMP1和DSPP急劇減少。Wang等[22]認(rèn)為BMP1和mTLL1蛋白酶的缺失破壞了牙本質(zhì)ECM正常形成礦化所需的膠原和非膠原蛋白水平的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致了膠原的異常堆積，并且積累的、經(jīng)過異常加工的膠原蛋白可能會(huì)干擾非膠原蛋白DMP1和DSPP水平的穩(wěn)態(tài)，從而出現(xiàn)了DGI樣表型。Zhang等[5]機(jī)制研究也顯示，dcKO小鼠牙本質(zhì)中成牙本質(zhì)細(xì)胞分化受到抑制，DMP1和DSPP的水平大大降低。此外，Dmp1-null[26]和Dspp-null小鼠都表現(xiàn)出相似的DGI樣表型，說明這兩種蛋白在牙本質(zhì)形成礦化中起關(guān)鍵作用[27-28]。上述數(shù)據(jù)支持BMP1和mTLL1在控制牙本質(zhì)的形成礦化及ECM膠原和非膠原蛋白穩(wěn)態(tài)中起重要作用。

Zhang等[5]研究分析表明，與正常小鼠相比，Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)細(xì)胞中Bmp1和Tll1失活的小鼠前期牙本質(zhì)層更寬，前期牙本質(zhì)層中雙鏈多糖(biglycan)的總體水平明顯更高，磨牙牙本質(zhì)中牙本質(zhì)涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)減少。DSP是DSPP的N端片段，是前期牙本質(zhì)-牙本質(zhì)復(fù)合物中最豐富的非膠原蛋白[5]。以往研究表明，DSPP的蛋白水解過程對(duì)于形成健康的牙本質(zhì)至關(guān)重要[29]。因此，推測(cè)dcKO小鼠的牙本質(zhì)或前期牙本質(zhì)中Ⅰ型膠原蛋白的切割失敗導(dǎo)致這些小鼠的牙齒缺陷，并且未能裂解DSPP也可能是造成dcKO小鼠牙本質(zhì)缺陷的另一個(gè)主要因素[5]。Steiglitz等[13]研究發(fā)現(xiàn)在Bmp1/Tll1-null小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF)培養(yǎng)中，DMP1的加工受到影響，這項(xiàng)研究表明BMP1和mTLL1在礦化組織形成中的進(jìn)一步作用是通過DMP1的蛋白水解作用實(shí)現(xiàn)的。綜上所述BMP1和mTLL1通過水解加工DSPP和DMP1這兩種蛋白質(zhì)，從而對(duì)牙本質(zhì)形成及礦化起促進(jìn)作用。

此外，一項(xiàng)關(guān)于豬牙本質(zhì)的研究表明，包括BMP1在內(nèi)的astacin蛋白酶裂解DSPP，并生成牙本質(zhì)唾液蛋白-牙本質(zhì)糖蛋白(dentin sialoprotein-dentin glycoprotein，DSP-DGP)復(fù)合物和牙本質(zhì)磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)[11]。另外，Yamakoshi等[30]發(fā)現(xiàn)從DSPP嵌合體中釋放DPP的起始裂解位點(diǎn)周圍的氨基酸(在Gly472和Asp473之間)與BMP1的靶位點(diǎn)序列相匹配，并設(shè)計(jì)了含有Gly472-Asp473的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)-DSPP肽，發(fā)現(xiàn)重組的人BMP1催化的FRET-DSPP肽正是在該DPP裂解位點(diǎn)裂解。Ritchie等[14]研究也證明了BMP1可以準(zhǔn)確處理?xiàng)U狀病毒表達(dá)的DSP-PP240，產(chǎn)生穩(wěn)定的PP240和DSP430。由此可見，BMP1參與加工水解DSPP。Muromachi等[12]研究結(jié)果表明，BMP1的作用不僅限于作為催化酶加工牙本質(zhì)特異性底物，還依賴于人類牙髓細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)在化作用來加速CCN2 / CTGF的產(chǎn)生從而參與骨樣修復(fù)性牙本質(zhì)的形成，闡明了BMP1的一種新特性：增強(qiáng)骨樣修復(fù)性牙本質(zhì)的形成。

4 BMP1和mTLL1在牙周組織發(fā)育中的作用

4.1 BMP1和mTLL1維持牙周穩(wěn)態(tài)

有學(xué)者通過構(gòu)建Bmp1和Tll1廣泛性敲除小鼠模型，結(jié)果顯示該小鼠牙周缺損進(jìn)行性發(fā)展，表現(xiàn)為畸形的牙周膜(periodontal ligament，PDL)(不規(guī)則的PDL纖維)、牙槽骨量顯著減少、牙骨質(zhì)減少并礦化不良(細(xì)胞牙骨質(zhì)急劇減少，無細(xì)胞牙骨質(zhì)附著功能出現(xiàn)病理變化)以及牙周破壞加速[31]。此外，Zhang等[5]構(gòu)建了Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)細(xì)胞中Bmp1和Tll1失活小鼠模型，結(jié)果顯示該小鼠牙槽骨缺失，PDL中的膠原纖維比對(duì)照組的小鼠厚，但并沒有發(fā)展成牙周袋。以上結(jié)果均表明，BMP1和mTLL1在維持牙周穩(wěn)態(tài)中起重要作用。為了進(jìn)一步探究BMP1和mTLL1在維持牙周穩(wěn)態(tài)中的單獨(dú)作用，Wang等[32]將單Bmp1廣泛性敲除小鼠和單Tll1廣泛性敲除小鼠與雙敲除小鼠進(jìn)行對(duì)比分析，單Bmp1廣泛性敲除小鼠與雙敲除小鼠均表現(xiàn)出嚴(yán)重的牙周缺損，其特征是PDL纖維丟失、擴(kuò)大的PDL區(qū)域中異位骨化以及牙槽骨和牙骨質(zhì)體積急劇減少，而單Tll1廣泛性敲除小鼠表現(xiàn)出非常輕微的表型，該結(jié)果表明在維持牙周穩(wěn)態(tài)中BMP1比mTLL1發(fā)揮更重要的作用。

4.2 BMP1和mTLL1影響牙周組織發(fā)育的機(jī)制

為進(jìn)一步研究其機(jī)制，Wang等[31]研究表明，BMP1和mTLL1廣泛缺失會(huì)導(dǎo)致PDL和牙槽骨中DMP1(成熟骨細(xì)胞的關(guān)鍵標(biāo)志物)水平顯著降低，成骨細(xì)胞標(biāo)志物骨唾液蛋白(BSP)和骨橋蛋白(OPN)的水平顯著增加，成骨細(xì)胞分化缺陷；基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metallopeptidase 13，MMP13)和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)表達(dá)顯著增加，破骨細(xì)胞明顯增加，而骨細(xì)胞和牙骨質(zhì)細(xì)胞減少；與ECM結(jié)構(gòu)缺陷相關(guān)的前膠原Ⅰ(Ⅰ型膠原的前體分子)的生物合成過程降低，從而未切割的前膠原Ⅰ顯著增加；骨膜蛋白(PDL功能必需的基質(zhì)蛋白)的水平變化與正常小鼠相似，表明該蛋白的缺陷不會(huì)導(dǎo)致異常PDL表型；最后，還證明了抗生素的全身應(yīng)用顯著改善了牙槽骨和PDL損傷，因此顯示它們是病原體引起炎癥的部分繼發(fā)性疾病。以往研究也表明DMP1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致PDL、牙槽骨和牙骨質(zhì)缺損，從而增加對(duì)細(xì)菌感染的易感性[33]。以上發(fā)現(xiàn)表明BMP1和mTLL1通過提供成熟的膠原蛋白Ⅰ和有活性的DMP1來維持牙周基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)；未切割的前膠原Ⅰ的積累、缺乏成熟的膠原蛋白Ⅰ以及活性DMP1的減少都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的牙周缺損，牙周缺損引起的炎癥可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的牙周破壞[31]。同時(shí)，Wang等[32]研究發(fā)現(xiàn)單Bmp1 廣泛性敲除小鼠與Bmp1和Tll1雙敲除小鼠牙周組織中成熟的Ⅰ型膠原蛋白大大減少、未切割的前膠原Ⅰ積累以及BSP、OPN、TRAP陽性細(xì)胞水平增加，而單Tll1廣泛性敲除小鼠的變化相較更為溫和。因此，Wang等[32]認(rèn)為BMP1，而不是mTLL1，在通過加工膠原蛋白前體來維持牙周穩(wěn)態(tài)中起著主導(dǎo)作用。

Zhang等[5]研究表明Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)細(xì)胞中Bmp1和Tll1失活的小鼠PDL的膠原纖維比正常小鼠厚，這表明BMP1和mTLL1的雙重缺失可能改變了PDL的膠原結(jié)構(gòu)。PDL中的主要膠原纖維是Ⅰ型膠原，并且以往研究表明BMP1和mTLL1充當(dāng)前膠原Ⅰ的蛋白酶[4，34]?？赏茰y(cè)dcKO小鼠中BMP1和mTLL1的缺失導(dǎo)致前膠原Ⅰ水解加工不良，而前膠原Ⅰ加工失敗可能是導(dǎo)致組裝異常、膠原纖維紊亂和增厚的主要因素之一[5]。 Syx等[21]透射電鏡分析也顯示，與BMP1基因突變相關(guān)的成骨不全癥患者的皮膚具有不規(guī)則的Ⅰ型膠原纖維，纖絲直徑可改變，并且某些纖絲比正常對(duì)照更厚。這與Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)細(xì)胞中Bmp1和Tll1失活的小鼠表現(xiàn)相似。

雖然Ⅰ型膠原蛋白是PDL的最主要成分，對(duì)組織至關(guān)重要，但眾所周知其他ECM分子，如骨膜蛋白和原纖蛋白-1等在健康PDL的形成和維持中也起著重要作用[35-36]。骨膜蛋白和原纖蛋白-1是PDL中的兩種ECM蛋白，其水平變化通常與PDL缺陷有關(guān)，Zhang等[5]研究表明，使小鼠Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)細(xì)胞中Bmp1和Tll1失活，均可導(dǎo)致小鼠的PDL中原纖蛋白-1水平明顯降低，而骨膜蛋白的水平與正常小鼠相似。 由于原纖蛋白-1的失活與人類的牙周疾病有關(guān)[37]，Zhang等[5]認(rèn)為原纖蛋白-1的水平降低可能是導(dǎo)致PDL結(jié)構(gòu)異常的原因，但是目前對(duì)原纖蛋白-1的急劇減少與dcKO小鼠的PDL中BMP1 / tolloid樣蛋白酶的丟失之間的關(guān)系尚無明確的說法。

5 小 結(jié)

綜上所述，BMP1和mTLL1作為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶，在切割和激活細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中發(fā)揮重要作用，促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞的分化，維持ECM中膠原和非膠原蛋白的穩(wěn)態(tài)，在牙齒發(fā)育中發(fā)揮重要作用。但目前牙齒發(fā)育的分子機(jī)制尚不十分明確，仍有許多問題待解決，如其他ECM蛋白加工缺陷與牙齒發(fā)育異常的關(guān)系以及牙齒發(fā)育過程中復(fù)雜的信號(hào)交換等。未來在進(jìn)一步研究的同時(shí)，也應(yīng)將人類牙齒發(fā)育缺陷與動(dòng)物模型相似的表型聯(lián)系起來，以便更好地了解這些疾病的病因，為臨床治療提供新思路。