付志斌王鵬志張秀琴

1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州730000

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）通常是由于股骨頭部位血液供應障礙，局部微循環(huán)障礙，致使骨髓細胞和骨細胞死亡，導致骨壞死，隨之壞死部分塌陷，引起關(guān)節(jié)功能障礙，影響患者生活質(zhì)量。隨著物質(zhì)生活的持續(xù)豐富，飲酒、吸煙、長期高劑量使用激素在日常生活中，這些不良生活習慣導致NONFH的發(fā)病率逐年升高，15歲以上人群中大約有800萬NONFH患者［1］。目前認為，NONFH與血管內(nèi)皮損傷、微循環(huán)障礙和骨代謝紊亂致使成骨細胞減少與凋亡相關(guān)［2，3］，其作用機制與Wnt信號通路調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）多向分化有密切聯(lián)系，本文就Wnt信號通路與BMSCs分化的相關(guān)研究進展做一綜述，并探討其與NONFH發(fā)病的相關(guān)性，以期為NONFH的防治提供新的思路。

1 BMSCs生物學特性

BMSCs存在于大多數(shù)胎兒和成人組織中，可在骨髓、臍帶血、胎盤、牙髓、脂肪組織和滑膜等組織中廣泛獲取。一方面，它是一種多能干細胞，可在體外增殖并向脂肪細胞、軟骨細胞、成骨細胞和血管內(nèi)皮細胞等多向分化［4，5］；另一方面，其分化潛能、體外擴增、組織修復、免疫調(diào)節(jié)、易獲性等，使BMSCs成為各種先天性和后天性疾病的理想治療方法［6］。雖然BMSCs存在體外復制衰老，從而限制了細胞擴增數(shù)量，但就其在再生醫(yī)學和生命科學的前景，仍讓眾多醫(yī)療工作者對其治療早中期NONFH充滿新的希望。

2 Wnt信號通路

Wnt信號通路是由配體蛋白Wnt、膜蛋白受體、胞內(nèi)信號傳遞成分、胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控成分組成，包括經(jīng)典Wnt信號通路（Wnt/β-catenin信號通路）和非經(jīng)典Wnt信號通路（平面細胞極性通路、Wnt/Ca+通路等）。Wnt配體蛋白通過激活細胞表面相應受體，誘導細胞極化，并激活其譜系特異性信號通路，進而對下游信號通路產(chǎn)生調(diào)控作用［7］。該信號通路廣泛存在于多細胞生物進化過程中且極具高度保守性與細胞依賴性，對細胞增殖、生長有較為重要的調(diào)控作用。有研究證明，其對骨細胞的增殖和分化、新生血管形成、炎癥反應也具有一定的調(diào)控作用［8］。

3 影響Wnt信號通路與BMSCs分化的因素

3.1 蛋白與基因的調(diào)節(jié)

3.1.1 脂聯(lián)素。脂聯(lián)素（adiponectin，APN）主要是由脂肪細胞合成并向血液中分泌的多功能激素蛋白［9］。研究表明，APN可通過自分泌或旁分泌途徑、內(nèi)分泌途徑影響胰島素信號通路作用于成骨細胞和破骨細胞進而影響骨代謝［10］。Wang Y等［11］在BMSCs分化過程中檢測到AdipoR1和AdipoR2的表達，重組了含有人APN基因的腺病毒，然后在體外將該腺病毒轉(zhuǎn)染到BMSCs或?qū)⑵渥⑷雱游锬Ｐ偷墓侨睋p區(qū)域，最后通過實時熒光定量PCR，免疫印跡與熒光，HE染色和顯微CT檢測到Wnt/β-catenin信號通路激活、成骨相關(guān)基因/蛋白表達增加和新骨形成，從而證明APN可以通過Wnt/β-catenin途徑促進BMSCs成骨分化和骨形成。

3.1.2 基因。MicroRNA（miRNA）是由多個核苷酸組成的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，在真核生物中可調(diào)節(jié)30%的基因表達。其通過靶定到mRNA3’非翻譯區(qū)來調(diào)節(jié)基因的表達，提示miRNA可為基因表達提供一種快速準確的調(diào)節(jié)機制，因此，miRNA調(diào)控網(wǎng)絡的錯亂，將引起多種疾患，如免疫性疾病、心血管疾病、癌癥、骨關(guān)節(jié)疾病等難治愈性疾病［12-15］。最近研究表明，miRNA是誘發(fā)NONFH最重要的影響因子之一，其表達量改變能造成嚴重的病理狀態(tài)［16］。而miRNA密切參與控制BMSCs成骨細胞分化的關(guān)鍵步驟，這為治療NONFH提供了新的方向［17］。miR-30e表達抑制可促進成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osx、Ocn、ALP和BSP的表達，同時抑制脂肪細胞的分化，增強成骨細胞的分化。LRP6是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵輔助受體和miR-30e的直接靶標，miR-30e通過抑制LPR6的表達來阻斷Wnt/β-catenin信號通路傳導，從而抑制BMSCs的多向分化［18］。Wang H等［19］在體外細胞培養(yǎng)實驗中證明miR-101通過靶向ezh2（mir-101的靶基因）激活了Wnt/β-catenin信號通路，而β-catenin抑制劑ICG-001抑制了β-catenin的表達。阻斷Wnt/β-catenin信號通路的傳導，從而逆轉(zhuǎn)了miR-101的促進作用，抑制BMSCs成骨分化，最終影響體內(nèi)骨形成。因此，可證明miR-101可通過靶向ezh2/wnt/β-catenin信號通路來促進成骨分化。Long H等［20］探討miR-139-5P和ALP在BMSCs成骨分化中的作用，通過檢測成骨基因的表達和ALP活性發(fā)現(xiàn)抑制miR-139-5P能顯著促進BMSCs向成骨細胞分化，其作用機制可能是通過miR-139-5P靶向Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵因子CTNNB1和Frizzled4（FZD4）在BMSCs成骨中發(fā)揮作用。

3.2 藥物有效成分與激素調(diào)節(jié)

3.2.1 小檗堿。中藥黃連的主要有效成分為小檗堿（Berberine，BBR），在臨床中常作為抗炎、抑菌、調(diào)脂等藥物［21］。現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，BBR可通過促進成骨細胞分化，抑制破骨細胞生成、骨吸收以及抑制脂肪生成而廣泛用于骨關(guān)節(jié)疾病。在諸多信號通路當中，Wnt信號通路在NONFH中研究頗多，參與調(diào)控骨代謝紊亂，維持成骨細胞與破骨細胞含量比，β-catenin、Runx2、DKK-1、β-catenin SiRNA等是Wnt信號通路的關(guān)鍵組成成分［22］。Tao K等［23］通過研究發(fā)現(xiàn)，BBR可激活Wnt/β-catenin信號通路，促使β-catenin進入細胞核，與Runx2啟動子上的TCF1形成復合物，隨后上調(diào)Runx2靶基因OPN和OCN表達，促進BMSCs向成骨分化，抑制成脂作用，最終增強BMSCs的成骨分化。

3.2.2 黃酮類化合物。黃酮類化合物是植物新陳代謝重要的次生代謝產(chǎn)物，包括黃酮、黃酮醇、黃烷醇、異黃酮和花色素等，具有影響血液流變、抗氧化、改善微循環(huán)、抗缺氧、抗炎、降低血管脆性等多種藥理作用［24］。黃酮類化合物可通過雌激素受體（ER）信號通路、BMP-2/Smads/Runx2/osterix信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路、NF-κB信號通路等影響成骨細胞分化［25］，其中Wnt/β-catenin信號通路可通過促進BMSCs向成骨細胞分化、減少成脂細胞分化，增加新骨生成量，從而延緩甚至逆轉(zhuǎn)早中期NONFH。Gu Q等［26］在體外培養(yǎng)細胞實驗中使用傳統(tǒng)中藥銀杏葉（GBE）刺激BMSCs分化，通過檢測BMP4、Runx2、β-catenin和細胞周期蛋白D1含量，發(fā)現(xiàn)這些檢測指標在GBE促進BMSCs成骨過程中顯著增加。同時，使用信號抑制劑進行功能喪失試驗，證實了BMP和Wnt/β-catenin信號通路在骨形成過程中至關(guān)重要。這表明，GBE可通過激活BMP和Wnt/β-catenin信號通路促進BMSCs向成骨細胞分化以提升骨形成量。Ying X等［27］探討楊梅黃酮類化合物對體外培養(yǎng)的BMSCs成骨分化的影響，使用MTT比色法、茜素紅S染料、堿性磷酸酶（ALP）活性測定、實時熒光定量PCR和Western blot分析評價成骨分化情況，發(fā)現(xiàn)楊梅黃酮類化合物能增強BMSCs分化過程中ALP活性、Runx2的mRNA表達和礦化作用。同時，楊梅素可激活Wnt/β-catenin信號通路，增加下游靶基因Runx2的表達，進而說明楊梅黃酮類化合物通過激活Wnt/β-catenin信號通路來增強BMSCs的成骨分化。

3.2.3 神經(jīng)激素。神經(jīng)激素是確保骨吸收和骨形成平衡的因素之一，其對骨代謝的影響是雙向的，取決于體內(nèi)激素含量的高低，當下丘腦β1和β2腎上腺素能系統(tǒng)激活時，骨組織中的β2受體激活骨形成并增加骨吸收；但是當外周β2受體慢性刺激時，可加快骨丟失并改變骨骼硬度。對骨代謝具有確切調(diào)控作用的神經(jīng)激素有神經(jīng)肽Y（NPY）和神經(jīng)酰胺U等［28，29］。NPY作為一種調(diào)節(jié)信號功能的激素，可在部分細胞和組織中促進BMSCs向成骨和成血管化分化。Wu J等［30］在誘導細胞增殖和抗凋亡過程中，發(fā)現(xiàn)NPY可激活Wnt/βcatenin信號通路，提高β-catenin和c-myc蛋白的基因和蛋白表達水平；同時，發(fā)現(xiàn)DKK1可抑制NPY的增殖和抗凋亡活性，DKK1還可阻斷β-catenin、PGSK-3β和c-myc蛋白的mRNA和蛋白表達。因此，此研究的結(jié)果表明，NPY在體外以適宜劑量通過Y1受體介導，并參與Wnt/β-catenin信號通路的激活，發(fā)揮對BMSCs增殖和保護作用?？傊?，神經(jīng)肽物質(zhì)可以通過促進β-catenin和c-myc等蛋白質(zhì)和基因的表達以及促進β-catenin的核轉(zhuǎn)位來激活Wnt/β-catenin信號傳導，提高BMSCs的存活率，進而發(fā)揮BMSCs成骨分化潛能［31］。

3.3 其他Sirtuin 1（sirt1）是調(diào)節(jié)BMSCs成脂和成骨分化的關(guān)鍵因子，其過度表達可抑制sfrp1、sfrp2和dact1的mRNA表達，激活Wnt/β-catenin信號通路，抑制BMSCs成脂細胞的基因轉(zhuǎn)錄，從而減少成脂細胞分化，增加成骨細胞分化［32］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（pparγ），是配體誘導核受體的核激素家族成員之一，參與諸多細胞內(nèi)的代謝過程，與骨代謝密切相關(guān)的BMP和Wnt，通過Wnt/β-catenin信號通路抑制pparγmRNA的表達，而其余Wnt信號通路通過激活組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，抑制pparγ的轉(zhuǎn)錄激活，從而抑制BMSCs向脂肪細胞分化［33，34］。

4 小結(jié)

BMSCs具備多向分化，易獲得，快速增殖，低免疫原性和高便攜性的能力，可以作為治療NONFH的理想種子細胞。因此，通過研究Wnt信號通路調(diào)控BMSCs多向分化的不同誘導因素，從而充分發(fā)揮BMSCs向成骨細胞和血管內(nèi)皮細胞分化的潛能，有研究發(fā)現(xiàn)，上述的多種蛋白及基因在NONFH的發(fā)病中也具有一定的調(diào)控作用［13］，所以二者存在一定的相關(guān)性。但是，同時也存在亟待解決的新問題：由于股骨頭壞死部位血液供應不足，細胞存活缺失營養(yǎng)和自由基的產(chǎn)生導致移植的BMSCs活力降低；存在許多與骨代謝相關(guān)的信號通路，彼此之間相互作用、錯綜復雜，故還需進一步研究各種誘導因素如何通過Wnt信號通路促使BMSCs向成骨分化的分子信號機制，對其機制的明確闡述有助于進一步發(fā)現(xiàn)NONFH的發(fā)病機制，從而為股骨壞死的防治發(fā)揮關(guān)鍵作用。為再生醫(yī)學和生命科學開辟新的領域，為科學研究和臨床醫(yī)生提供治療NONFH的新思路，為NONFH患者帶來減輕疾病疼痛的新希望。