清血消脂方對(duì)小鼠銀屑病合并脂代謝紊亂模型的干預(yù)作用

張蕾，李萍，劉衛(wèi)紅，林燕，解欣然

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所，北京 100010)

針對(duì)銀屑病的治療不再局限于皮膚，而需考慮系統(tǒng)性治療。其中，銀屑病合并脂代謝紊亂最為普遍，主要表現(xiàn)為總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平升高，高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)組分降低[1]；皮損處也表現(xiàn)為脂類代謝異常[2]。脂代謝紊亂是代謝綜合征、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)，影響疾病的發(fā)展和預(yù)后。清血消脂方是北京中醫(yī)醫(yī)院名老中醫(yī)黃麗娟教授用于治療高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的有效中藥復(fù)方，實(shí)驗(yàn)研究表明能夠降低高脂血癥動(dòng)物模型的脂代謝紊亂，抑制小鼠的代謝性炎癥反應(yīng)[3]。臨床研究也表明清血消脂方能改善患者脂代謝紊亂[4-5]。筆者采用咪喹莫特誘導(dǎo)載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)敲除小鼠模擬高脂狀態(tài)基礎(chǔ)上的銀屑病，進(jìn)行銀屑病合并脂代謝紊亂的病理機(jī)制和藥物研究[6]。本文嘗試將清血消脂方作用于咪喹莫特誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠模型，觀察其對(duì)銀屑病合并脂代謝紊亂的影響，為臨床治療銀屑病合并癥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性ApoE-/-小鼠24只，28周齡；雄性C57BL/6J小鼠8只，28周齡。小鼠均購(gòu)自北京華阜康生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。飼養(yǎng)條件為：室溫18～22 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，晝夜12 h交替照明。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)處理均嚴(yán)格遵守美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用手冊(cè)》(NIH Publication No.85-23，1996)，并遵循動(dòng)物福利原則及首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

1.2藥物和試劑 清血消脂方(虎杖15 g、大黃10 g、蒲黃10 g、姜黃10 g、澤瀉15 g、萆薢10 g、茵陳15 g、白術(shù)12 g、石菖蒲10 g、紅花5 g)，以上中藥飲片由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部提供，制備為水煎液。實(shí)驗(yàn)劑量根據(jù)臨床等效劑量換算為生藥計(jì)量22.4 g·kg-1，按10 mL·kg-1灌胃[7]。阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：DE7888)；用0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose，CMC)溶液配制，按10 mg·kg-1灌胃；咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：18080439)；戊巴比妥鈉(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：018K0754)；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(德國(guó)Leica公司，批號(hào)：120216)；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)兔單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：REV08/16/16)；Involucrin兔多克隆抗體、凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(lectin like oxLDL receptor-1，LOX-1)兔多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為GRB7751-24，GR225261-17)；FITC anti-mouse CD4，APC anti-mouse IFN-γ，PE anti-mouse IL-17A，Cell Stimulation Cocktail等(美國(guó)Affymetrix eBioscience公司，批號(hào)分別為2037887，193640，2023658，200547)；Mouse/Rat Soluble Protein Master Buffer Kit、IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-12/IL-23p40(美國(guó)Becton，Dickinson公司，批號(hào)：93746)；Dupint NEN TSA-Indirect Tyramide Signal Amplification Kit (美國(guó)Dupint公司，批號(hào)：1798654)；TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：235005)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)、DL2000 DNA Marker[寶生物工程(大連)有限公司，批號(hào)分別為AK4102、AK5504、A2301A]；引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。

1.3主要儀器 3-18K型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)希格瑪實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)公司)；ASP6025全自動(dòng)真空組織脫水機(jī)、EG1150H石蠟包埋機(jī)、RM2255全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、全自動(dòng)染色機(jī)及Aperio CS2臺(tái)式玻片掃描儀(德國(guó)Leica公司)；Cobas C601全自動(dòng)生化分析儀(瑞士羅氏公司)；FACSVerse流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton，Dickinson and Company公司)；LSM780激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司)；ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；Multiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶聯(lián)免疫測(cè)定儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)等。

1.4動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 小鼠適應(yīng)1周后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組：正常對(duì)照組(C57BL/6J小鼠)、模型對(duì)照組(ApoE-/-小鼠)、清血消脂方組(ApoE-/-小鼠)和阿托伐他汀鈣組(ApoE-/-小鼠)，每組8只。清血消脂方組(22.4 g·kg-1)和阿托伐他汀鈣組(10 mg·kg-1)，按10 mL·kg-1灌胃給藥。3周后，全部小鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(80 mg·kg-1)，背部去毛后單籠飼養(yǎng)。次日給予全部ApoE-/-小鼠均勻涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg，同時(shí)給予相應(yīng)藥物；正常對(duì)照組C57BL/6J小鼠涂抹等量凡士林，正常對(duì)照組和模型組灌胃等量純水，連續(xù)5 d。

1.5檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.5.1小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評(píng)分 每天觀察小鼠皮損情況，并采用數(shù)碼照相，依據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，給予小鼠皮損處紅斑、鱗屑及浸潤(rùn)程度(0：無(wú)；1：輕度；2：中度；3：重度；4：極重度)打分，將三者積分相加得到總積分，取平均值后繪制趨勢(shì)線，觀察各組小鼠皮損的變化情況。

1.5.2小鼠皮損組織病理學(xué)變化 將小鼠用戊巴比妥鈉注射處死后，剪取皮損處皮膚，每組3只，浸沒(méi)于10%甲醛溶液中，固定48 h；常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色，用中性樹(shù)膠封片。Leica玻片掃描儀掃描并獲取圖像(20倍)，每個(gè)標(biāo)本選視野4個(gè)，采用 Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)量表皮厚度。

1.5.3小鼠皮損Involucrin、PCNA和LOX-1的表達(dá) 選取皮膚組織蠟塊，每組3只，切片，使用Dupont NEN TSA-Indirect Tyramide Signal Amplification Kit，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行[8]。依次脫蠟、封閉、一抗孵育，抗體稀釋濃度：外皮蛋白(Involucrin)1：1500、PCNA 1：2500、LOX-1 1：1500，4 ℃孵育過(guò)夜；HRP標(biāo)記的豬抗兔IgG 室溫孵育30min；Biotinyl Tyramide室溫孵育10 min；Treptavidin fluorescence 37 ℃孵育10 min；防淬滅封片劑封片。Zeiss激光共聚焦顯微鏡下(20倍物鏡)攝像，波長(zhǎng)分別為405，490，647，550 nm，原位合并圖像。

1.5.4小鼠血脂水平 將小鼠麻醉后眼球取血，每組8只，1123×g，離心10 min，取血清，-80℃冰箱保存。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TC、TG、LDL、HDL水平，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5.5小鼠脾臟Th1/Th17細(xì)胞計(jì)數(shù) 選取小鼠脾臟，每組4只，制備為單細(xì)胞懸液，加細(xì)胞混合刺激劑(PMA+Iionomysin+BFA)，37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱孵育4 h；加入CD4-FITC抗體，室溫避光反應(yīng)20 min；固定后加破膜劑，加干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和 IL-17A抗體，室溫避光反應(yīng)30 min；清洗后加PBS重懸混勻進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

1.5.6小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子水平 采用流式微珠陣列(cytometric bead array，CBA)法檢測(cè)小鼠血清中IL-17A、IL-17F、IL-12/IL-23p40和IL-6含量，每組6只，具體操作按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用FCAP Array software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5.7小鼠皮損中炎癥細(xì)胞因子基因表達(dá) 采用realtime PCR法檢測(cè)小鼠皮損中炎癥細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-23和IL-6的mRNA表達(dá)。TRIzol法提取小鼠皮膚總RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋呵疤幚?5 ℃ 30 s，(擴(kuò)增95 ℃，5 s，退火60 ℃，40 s)×45個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本重復(fù)3次。結(jié)果以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。引物序列見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1小鼠皮損和PASI評(píng)分 咪喹莫特外涂于小鼠背部皮膚5 d后，模型對(duì)照組小鼠背部皮損增厚、浸潤(rùn)顯著，大量斑塊狀鱗屑，皮色紅。清血消脂方組小鼠皮損紅斑和鱗屑明顯減少，浸潤(rùn)減輕。模型對(duì)照組小鼠PASI評(píng)分隨天數(shù)持續(xù)增高，清血消脂方組第3天開(kāi)始明顯降低(圖1)。

表1 引物序列

2.2小鼠皮損病理形態(tài)和表皮厚度 顯微鏡下觀察可見(jiàn)正常對(duì)照組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮層薄，僅1～2層。模型對(duì)照組小鼠表皮層明顯增厚，出現(xiàn)角化不全和角化過(guò)度，真皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。清血消脂方組小鼠表皮層結(jié)構(gòu)較平整，角化不全明顯減輕，表皮厚度減少(圖2)。采用圖像分析軟件測(cè)量小鼠表皮厚度，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠表皮層明顯增厚(P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，清血消脂方組小鼠皮膚組織表皮厚度明顯降低(P<0.05)(圖3)。

2.3小鼠表皮增殖、分化和脂質(zhì)堆積指標(biāo) 采用免疫熒光染色法觀察小鼠Involucrin、PCNA和LOX-1的表達(dá)。正常對(duì)照組小鼠表皮層薄，Involucrin(紅色)和PCNA(綠色)表達(dá)不明顯，LOX-1(綠色)少量表達(dá)；模型對(duì)照組表皮層明顯增厚，Involucrin表達(dá)顯著，基底層PCNA表達(dá)數(shù)量顯著增多，表皮和真皮層均可見(jiàn)LOX-1陽(yáng)性表達(dá)。清血消脂方組小鼠Involucrin表達(dá)略有減少，PCNA和LOX-1表達(dá)明顯降低(圖4)。

2.5小鼠血脂水平 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠TC、TG、HDL和LDL明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。清血消脂方可顯著降低TG，升高HDL和LDL水平，其作用趨勢(shì)與阿托伐他汀鈣相一致，見(jiàn)表2。

①與正常對(duì)照組比較，t=8.837 8～21.213 4，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=0.196 5～8.018 0，P<0.05。

圖2 4組小鼠皮膚組織病理變化(HE，×200)

①與正常對(duì)照組比較，t=21.136 9，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=5.266 5，6.050 4，P<0.05。

2.6小鼠血清炎癥因子水平 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清中IL-17A、IL-17F、IL-12/IL-23p40和IL-6顯著升高(P<0.05)。清血消脂方對(duì)IL-17F有一定的抑制作用(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.7小鼠皮損炎癥因子基因表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清中IL-17A、IL-17F、IL-23和IL-6 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。清血消脂方可抑制炎癥因子IL-17A、IL-23和IL-6基因表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

3 討論

“異病同治”是中醫(yī)辨證論治理論中的基本治則，即不同的疾病在其發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)相同的病機(jī)可采用同一方法治療。近年來(lái)，基于“濕邪內(nèi)生”“從濕論治”提出銀屑病具有“內(nèi)濕外燥，燥濕互化”的病機(jī)特點(diǎn)[9]?！皾瘛毙柏灤┯诩膊〉氖冀K，燥濕、血瘀、熱毒三者互結(jié)是銀屑病的基本病機(jī)。脂代謝紊亂屬于“痰濁”范疇，“痰瘀互結(jié)”、“中滿內(nèi)熱”是脂代謝紊亂的主要病機(jī)[10-12]。銀屑病和脂代謝紊亂的病機(jī)中都包含“(痰)濕”這一病機(jī)，(痰)濕、熱毒、瘀血既是疾病產(chǎn)生的病理產(chǎn)物，又是致病因素。病邪蘊(yùn)積體內(nèi)，痹阻血脈，為痰飲，為血瘀，甚則胸痹；溢于皮之絡(luò)脈，則為白疕。由此，從中醫(yī)學(xué)角度闡釋銀屑病和脂代謝紊亂具有相同的病機(jī)，并在同一機(jī)體中同時(shí)出現(xiàn)，可采用“異病同治”的治則。

清血消脂方中虎杖利濕散瘀，大黃通腑降濁、活血祛瘀，使?jié)釟庀滦星鍤馍仙?，為君藥。蒲黃、姜黃行氣活血，助虎杖、大黃活血之力，消其苦寒之弊，茵陳、澤瀉、萆薢利濕濁、化痰飲，為臣藥。佐以白術(shù)、石菖蒲化濕和胃，開(kāi)竅醒脾。紅花為使藥，引諸藥之力祛除血脈之瘀滯。諸藥合用，活血消瘀，祛濕化濁，通腑泄熱。清血消脂方臨床等效劑量可降低ApoE-/-小鼠體內(nèi)血脂水平，抑制小鼠血清及脂肪細(xì)胞炎癥因子IL-6、MIP-1和MCP-1α表達(dá)水平，并通過(guò)調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor，NF)-κB和過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)-γ受體，抑制炎癥反應(yīng)[5]。清血消脂方可抑制ApoE-/-小鼠肝臟和巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞內(nèi)清道夫受體CD36(cluster of differentiation 36，CD36)、清道夫受體A(scavenger receptor A，SR-A) mRNA和蛋白的表達(dá)，減少巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的攝入，抑制泡沫細(xì)胞的形成[13]；清血消脂方能夠干預(yù)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的糖脂類代謝[14]。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.清血消脂方組；D.阿托伐他汀鈣組。

清血消脂方可顯著改善咪喹莫特誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠銀屑病樣皮損，鱗屑和紅斑減少、浸潤(rùn)減輕，表皮厚度變薄，并抑制表皮基底層細(xì)胞增殖(PCNA)、角化不全(Involucrin)，減少表皮脂質(zhì)堆積(LOX-1)，降低PASI評(píng)分。PCNA是真核細(xì)胞DNA合成所需的核蛋白，在G1期逐漸增加，S期達(dá)到高峰，G2/M期減少，可反映細(xì)胞的增殖活性[15]。模型組小鼠角化不全明顯升高，而清血消脂方對(duì)其有明顯降低作用。LOX-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞oxLDL的主要受體，模型組小鼠皮損中表現(xiàn)出脂質(zhì)聚積，與銀屑病患者皮損存在脂質(zhì)代謝異常的報(bào)道一致[1]。清血消脂方能夠明顯抑制LOX-1表達(dá)，減少皮膚的脂質(zhì)堆積。清血消脂方降低TG水平、升高HDL組分，與阿托伐他汀鈣作用結(jié)果一致。TG水平主要受飲食影響，所以普通飼料飼養(yǎng)的復(fù)合模型小鼠TG升高不明顯，但在連續(xù)4周灌服中藥后，觀察到清血消脂方對(duì)降低TG的作用。應(yīng)用脂質(zhì)檢測(cè)技術(shù)證明，降低銀屑病患者HDL膽固醇外排能力(cholesterol efflux capacity，CEC) 有利于調(diào)節(jié)血脂水平[16]。因此，清血消脂方降低TG、升高HDL可抑制脂代謝紊亂向動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

①與正常對(duì)照組比較，t=14.748 9，8.639 9，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，t=1.929 2～6.134 2，P<0.05。

表2 四組小鼠血脂水平

銀屑病和脂代謝紊亂都伴有炎癥細(xì)胞的激活和炎癥細(xì)胞因子的升高。銀屑病被認(rèn)為是Th1/Th17/Th22細(xì)胞亞群自身免疫性疾病，IL-23/Th17軸起主導(dǎo)作用[17]。咪喹莫特誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠復(fù)合模型表現(xiàn)出系統(tǒng)性和局部皮損的IL-23/Th17軸激活，表現(xiàn)為皮膚、脾臟和血清中相關(guān)免疫細(xì)胞和炎癥因子的升高，與咪喹莫特對(duì)BALB/c小鼠的免疫發(fā)病機(jī)制一致[6，18]。炎癥因子如IL-17A升高可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇升高，進(jìn)入循環(huán)導(dǎo)致血液膽固醇水平升高，這可能是銀屑病患者發(fā)生脂代謝紊亂的原因[19]。文獻(xiàn)報(bào)道，他汀類藥物有益于銀屑病的治療可能通過(guò)抑制IL-17A信號(hào)途徑[20]。

表3 4組小鼠血清炎癥因子水平

表4 4組小鼠皮損炎癥因子mRNA表達(dá)

清血消脂方可顯著降低小鼠脾臟Th1和Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.05)，抑制皮損中炎癥因子IL-17A、IL-23和IL-6的基因表達(dá)；同時(shí)對(duì)血清中炎癥因子IL-17F水平有一定的抑制作用。因此，清血消脂方可通過(guò)抑制IL-23/Th17軸發(fā)揮對(duì)銀屑病的干預(yù)作用。

綜上所述，清血消脂方能夠明顯改善咪喹莫特誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠銀屑病樣皮損，減少鱗屑和紅斑，降低PASI評(píng)分，抑制表皮細(xì)胞增殖、角化不全，減少表皮脂質(zhì)堆積；調(diào)節(jié)血脂水平；抑制局部皮膚和全身IL-23/Th17軸激活。因此，清血消脂方通過(guò)抑制IL-23/Th17軸改善銀屑病樣皮損，從而發(fā)揮對(duì)銀屑病合并脂代謝紊亂的干預(yù)作用。此外，本研究提示調(diào)節(jié)脂代謝紊亂也可能作為治療銀屑病的一個(gè)新的有效策略。