復(fù)方丹參膠囊對替格瑞洛在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響及其機制

周帥，韓戰(zhàn)營，遲驍瑋

(1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，河南 450052；2.國家衛(wèi)生健康委員會醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心，北京 100044)

急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)主要是由動脈粥樣硬化斑塊破裂導(dǎo)致組織因子和膠原蛋白的暴露引發(fā)血小板活化與聚集而引起，最終形成血栓[1-2]。作為冠心病中發(fā)病率、死亡率最高的類型，主要包括不穩(wěn)定性心絞痛、非ST段抬高型心肌梗死和ST段抬高型心肌梗死[3]。血小板在ACS血栓形成的過程中發(fā)揮著重要的作用，故抗血小板藥是目前抗血栓形成的主要治療策略[4-5]。

替格瑞洛是環(huán)戊基三唑嘧啶類新型口服抗血小板藥物，可逆性地與P2Y12受體結(jié)合，于2012年通過原國家食品藥品監(jiān)督管理局(NMPA)審批正式進入中國市場[6]。PLATO研究表明，替格瑞洛可顯著降低心血管死亡、心肌梗死及腦卒中發(fā)生率及死亡率，不良反應(yīng)較小[7]。與傳統(tǒng)P2Y12受體拮抗劑比較，替格瑞洛具有起效迅速，停藥后恢復(fù)較快，不受年齡、性別、飲食影響等優(yōu)勢[8]。研究表明，替格瑞洛口服后吸收迅速，主要分布于血液，可與血漿蛋白廣泛結(jié)合(>99%)[9-10]；該藥大部分經(jīng)CYP3A5代謝生成活性代謝產(chǎn)物AR-C124910XX，部分經(jīng)CYP3A4代謝生成AR-C133913XX，此外，替格瑞洛主要由P糖蛋白(P-gp)等轉(zhuǎn)運體進行外排[11]。食物及藥物等同服均可影響其體內(nèi)的代謝清除，HOLMBERG等[12]研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)服用西柚汁可抑制CYP3A進而使替格瑞洛的血藥峰濃度(Cmax)及血藥濃度-時間曲線下面積(AUC)增加65%和121%，使消除半衰期延長1.1倍。而與利福平同服后，健康志愿者體內(nèi)替格瑞洛的Cmax、AUC和t1/2分別降低73%，86%和67%[13]。

復(fù)方丹參膠囊主要由丹參、三七及冰片組成，其中酚酸類具有提高機體纖溶及抗凝活性、抗血栓、抗血小板聚集、抗氧化、保護心臟微血管內(nèi)皮細胞、改善微循環(huán)障礙等作用[14]；皂苷類可顯著改善血管內(nèi)皮細胞功能、抑制血管平滑肌細胞增殖、抗血栓形成、擴張血管及保護心肌[15]。有研究發(fā)現(xiàn)丹參提取物可顯著增強抗血小板聚集活性[16]。復(fù)方丹參膠囊也可顯著提高氯吡格雷的抗血栓、抗血小板聚集、抗氧化等作用[17]，故常與替格瑞洛合用于心血管疾病治療中。研究發(fā)現(xiàn)，丹參提取物可調(diào)控CYP3A活性[18]，但復(fù)方丹參膠囊對替格瑞洛藥動學(xué)的影響未見報道，因此，筆者研究了復(fù)方丹參膠囊對替格瑞洛在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1儀器 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(AB ScieX Qtrap 4000三重四級桿質(zhì)譜儀；安捷倫1100高效液相色譜系統(tǒng)；Analyst TF 1.5 Software數(shù)據(jù)采集分析軟件)；冷凍高速離心機(美國Thermo Fish公司)；超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；超微量電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，感量：0.1 mg)；微量移液器(德國Eppendorf公司)。

1.2藥品與試劑 復(fù)方丹參膠囊(規(guī)格：每粒30 mg，批號：D17A005，云南白藥集團股份有限公司)；替格瑞洛片(規(guī)格：每片90 mg，批號：TDKT，阿斯利康制藥有限公司)；替格瑞洛對照品(批號：L1613016，含量：99.5%，上海阿拉丁公司，貨號：T125095)；咪達唑侖對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量：99.8%，貨號：130557，批號：130557-201604)；CYP3A2抗體(美國Abcam公司，批號：ab195627)；RNAiso Plus(Takara公司，批號：9108)；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技，批號：KR106-03)；SuperReal PreMix熒光定量PCR試劑盒(天根生化科技，批號：FP205)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Fisher公司)；醋酸銨(分析純，美國Fisher公司)；甲酸(分析純，上海阿拉丁有限公司)，所有其他溶劑和化學(xué)試劑均為分析純或以上。

1.3實驗動物 Sprague-Dawley大鼠，SPF級，雄性，體質(zhì)量200～240 g，購自北京維通利華技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2017-0028，飼養(yǎng)于河南省實驗動物中心。大鼠的飼養(yǎng)、使用、操作等均符合中國《實驗動物管理條例》。大鼠于室溫18～24 ℃，相對濕度(65±5)%，明暗交替12 h的條件下環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實驗。本研究中動物實驗方案獲得鄭州大學(xué)實驗動物管理與使用委員會批準。

1.4方法

1.4.1藥動學(xué)實驗 采用平行對照實驗，16只雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機分為兩組，對照組與復(fù)方丹參膠囊組，分別連續(xù)7 d每天灌胃給予等量0.9%氯化鈉溶液、復(fù)方丹參膠囊(將18 mg復(fù)方丹參膠囊溶于0.9%氯化鈉溶液1 mL中，制備成復(fù)方丹參膠囊灌胃用制劑18 mg·mL-1，按大鼠體質(zhì)量每200克給予1 mL復(fù)方丹參膠囊灌胃用制劑，即給藥劑量為90 mg·kg-1)。第8天給藥前12 h禁食不禁水，第8天分別給予兩組大鼠0.9%氯化鈉溶液、復(fù)方丹參膠囊30 min后，灌胃給予兩組大鼠替格瑞洛(將4 mg替格瑞洛溶于0.9%氯化鈉溶液1 mL中制成替格瑞洛溶液灌胃用制劑4 mg·mL-1，按大鼠體質(zhì)量每200克給予1 mL替格瑞洛灌胃用制劑。即給藥劑量為20 mg·kg-1，i.g.)，并在給藥前、給藥后0.08，0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，10，24及36 h于大鼠眼內(nèi)眥采血0.25 mL，置于肝素鈉抗凝的離心管中，3000 r·min-1離心10 min(r=10 cm)，取血漿置于-80 ℃保存待測。

1.4.2肝微粒體的制備 大鼠藥動學(xué)實驗完成后，采用烏拉坦(50%，W/V)腹腔注射麻醉，取出肝臟，用預(yù)冷的沖洗液沖洗肝臟2或3次至土黃色并用濾紙吸干，剪取同部位肝臟組織在冰浴條件下切碎，按1：4加入的Tris-HCl(0.05 mol·L-1)制備肝勻漿液。采用差速離心法制備大鼠肝微粒體，9000×g4 ℃離心20 min，小心取上清液后100 000×g4 ℃離心60 min，棄上清液，沉淀用Tris-HCl(0.15 mol·L-1)洗滌，100 000×g4 ℃離心60 min，所得肝微粒體均勻混懸于蔗糖(250 mmol·mL-1)中，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用考馬斯亮藍法測定肝微粒體總蛋白濃度。

1.4.3復(fù)方丹參膠囊對大鼠肝臟CYP3A mRNA表達的影響 藥動學(xué)實驗結(jié)束后采取腹主動脈采血并處死各組大鼠，分別取出兩組大鼠的肝臟置于干冰中。用RNA提取試劑盒提取肝組織中總RNA，將RNA用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，取稀釋后的cDNA 4 μL，分別加入CYP3A1及CYP3A2的引物和熒光標記探針，利用SuperReal PreMix熒光定量PCR試劑盒，在iQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad Laboratories)上進行擴增反應(yīng)(反應(yīng)參數(shù)見表1)，檢測mRNA表達水平?；虮磉_數(shù)據(jù)用內(nèi)參β-actin進行校正，相對表達差異采用熒光定量PCR實驗中常用的ΔΔCt的方法。

表1 CYP3A1和CYP3A2基因引物序列

1.4.4復(fù)方丹參膠囊對大鼠肝臟CYP3A2蛋白表達的影響 提取肝組織中總蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，采用5%BSA封閉2 h后孵育一抗，加入一抗(1：600)、β-actin(1：3000)，4 ℃孵育過夜。在室溫條件下采用搖床將二抗孵育2 h。采用Tris-HCl與吐溫等滲緩沖鹽溶液(TBST)將PVDF膜洗滌3次，每次15 min，加入化學(xué)發(fā)光顯色試劑(ECL)顯色劑。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)檢測，分析目的條帶/對應(yīng)內(nèi)參的相對表達量。

1.4.5復(fù)方丹參膠囊對大鼠肝臟CYP3A酶活性的影響 采用CYP3A特異性探針底物咪達唑侖(midazolam，MDZ)來檢測酶活性。肝微粒體孵育反應(yīng)體系為100 μL，在大鼠肝微粒體(0.3 mg·mL-1)中分別加入MDZ(20，50，100 μmol·L-1)，磷酸鹽(PBS)緩沖液(0.1 mol·L-1，pH值7.4)，于37 ℃預(yù)孵育5 min，加入NADPH(1 mmol·L-1)啟動反應(yīng)，孵育20 min后將樣品迅速置于冰浴中，并立即加入冰乙腈終止反應(yīng)，渦旋振蕩2 min，15 000×g離心10 min，取上清液20 μL進樣。代謝消除率=(加入探針底物的量-測得探針底物的量)/加入探針底物的量。

1.4.6測定方法 按照文獻中大鼠血漿中替格瑞洛的測定方法[19-20]，對所采用的方法分別進行了專屬性、線性、精密度與回收率、基質(zhì)效應(yīng)及穩(wěn)定性等驗證，結(jié)果均符合《中華人民共和國藥典》2020年版生物樣品定量分析要求。具體條件如下。

(1)色譜條件。色譜柱為Phenomenex C18(2.1 mm×50 mm，2.1 μm)；進樣量：5 μL；流動相：甲醇-0.1%甲酸(80：20)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；內(nèi)標：硝苯地平。替格瑞洛在大鼠血漿中的線性范圍為5～2000 ng·mL-1。

(2)質(zhì)譜條件。采用負離子電噴霧離子源多反應(yīng)模式進行監(jiān)測，替格瑞洛和內(nèi)標(硝苯地平)的離子對分別為m/z521.4→361.1，內(nèi)標528.3→368.1。替格瑞洛的去簇電壓(DP) 和碰撞能(CE) 值分別為-99.26 V和-32.56 V；內(nèi)標的去簇電壓(DP) 和碰撞能(CE) 值分別為-55.35 V和-42.85 V；掃描時間100 ms，碰撞氣壓95.05 kPa，氣簾氣325.90 kPa，離子源噴射電壓5500 V，離子源溫度600 ℃，源內(nèi)氣體1(GS1)425.30 kPa，源內(nèi)氣體2(GS2) 385.05 kPa。

(3)血漿樣品處理。采用蛋白沉淀法處理血漿樣品。取血漿樣品100 μL，加入含內(nèi)標的沉淀劑(甲醇：乙腈=1：1)400 μL，渦旋1 min，14000 r·min-1離心10 min(r=10 cm)，取上清液5 μL進樣分析。

1.4.7方法學(xué)驗證

(1)專屬性。分別取空白血漿、空白血漿及替格瑞洛、大鼠給藥后血漿樣品，按“2.5”項下方法處理。結(jié)果顯示，血漿內(nèi)源性物質(zhì)基本對替格瑞洛和內(nèi)標的測定無干擾。替格瑞洛與內(nèi)標的峰形良好，分離良好，保留時間分別為2.42，3.49 min，表明方法學(xué)專屬性好，可滿足生物樣品的測定要求。

(2)線性范圍。采用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法，以待測物與內(nèi)標的峰面積比值(Y)分別對替格瑞洛的濃度(X)進行線性回歸，替格瑞洛的回歸方程為：Y=7.63×10-4X-4.28×10-4(r=0.998 8)。線性范圍為5～2000 ng·mL-1，最低定量下限為5 ng·mL-1，說明方法靈敏度較高。

(3)精密度與回收率。分別精密量取對照品溶液與空白血漿渦旋混勻，制成低、中、高3種質(zhì)量濃度(10，100，1000 ng·mL-1)，按“2.5”項下方法處理，連續(xù)3 d進行測定，替格瑞洛日內(nèi)精密度RSD分別為7.2%，5.9%，3.4%，日間精密度RSD分別為9.6%，7.1%，3.5%，回收率分別為(90.3±2.4)%，(91.7±3.6)%，(94.6±4.5)%。內(nèi)標的回收率為(92.8±1.9)%。

(4)穩(wěn)定性。制備中濃度(100 ng·mL-1)的替格瑞洛標準血漿樣品，按“2.5”項下方法處理，分別置于室溫下4 h、4 ℃自動進樣器中10 h、-20 ℃反復(fù)凍融3次及-20 ℃放置30 d，考察不同存放條件下樣品的穩(wěn)定性。4種條件下RSD均<8.7%。表明處理后的樣品在上述4種條件下穩(wěn)定性符合生物樣本的分析要求。

(5)基質(zhì)效應(yīng)。分別取空白血漿，按“1.4.5”項下方法處理，分別加入低、中、高濃度的標準品溶液，渦旋后進行測定(A)，同時測定相同濃度的對照品溶液(B)，以兩者峰面積比值(A/B)求得基質(zhì)效應(yīng)。替格瑞洛的基質(zhì)效應(yīng)分別為85.2%，89.3%和92.1%。內(nèi)標溶液經(jīng)同法處理，計算得基質(zhì)效應(yīng)為91.7%。表明本方法基質(zhì)效應(yīng)符合生物樣本的分析要求。

2 結(jié)果

2.1復(fù)方丹參膠囊對替格瑞洛大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響 兩組大鼠血漿中替格瑞洛的時間-藥物濃度曲線見圖1，相應(yīng)的藥動學(xué)參數(shù)見表2。由結(jié)果可知，與對照組比較，復(fù)方丹參膠囊組大鼠血漿中替格瑞洛Cmax、AUC0-t及AUC0-∞顯著降低32.03%，30.65%及30.89%(P<0.01)，而CL/F、Vz/F顯著升高至1.43及1.37倍(P<0.01)。

2.2復(fù)方丹參膠囊對大鼠肝臟CYP3A1及CYP3A2 mRNA表達的影響 與對照組比較，復(fù)方丹參膠囊組的CYP 3A1及 CYP 3A2 mRNA表達水平均增加至對照組(1.23±0.57)及(3.33±1.19)倍(P<0.05)。結(jié)果表明，復(fù)方丹參膠囊可能誘導(dǎo)CYP3A2 mRNA表達，但對CYP3A1 mRNA表達無顯著性影響(P>0.05)。見圖2。

圖1 替格瑞洛在大鼠體內(nèi)的血藥濃度-時間曲線

2.3復(fù)方丹參膠囊對大鼠肝臟CYP3A2蛋白表達的影響 與對照組比較，復(fù)方丹參膠囊組肝臟CYP3A2蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4復(fù)方丹參膠囊對大鼠CYP3A酶活性的影響 對照組及復(fù)方丹參膠囊組大鼠肝微粒體CYP3A底物MDZ的代謝消除率如表3所示。由此可知，復(fù)方丹參膠囊可誘導(dǎo)大鼠CYP3A酶活性。

3 討論

研究表明，復(fù)方丹參膠囊可提高抗血小板聚集，抗血栓形成、抗氧化等藥理活性，具有顯著降低心血管不良事件，且常與抗血小板藥物合用[8]。本實驗所選用復(fù)方丹參膠囊及替格瑞洛的劑量為80及20 mg·kg-1，均為所對應(yīng)的臨床等效劑量，且選用平行對照多劑量給藥，更符合臨床用藥規(guī)律。藥動學(xué)結(jié)果顯示，單次灌胃給予大鼠替格瑞洛(20 mg·kg-1)后替格瑞洛在大鼠體內(nèi)約1.13 h達到峰濃度，吸收速度較快；消除半衰期也較短，表觀分布容積較大。此結(jié)果與文獻[10]中研究結(jié)果相似。

連續(xù)7 d灌胃給予復(fù)方丹參膠囊后，大鼠體內(nèi)替格瑞洛的Cmax、AUC0-t及AUC0-∞顯著降低(P<0.05)，

且使替格瑞洛的CL/F、Vz/F顯著升高(P<0.05)。暴露量的降低可能由吸收減少、代謝增多、分布增多所致。因替格瑞洛在人體內(nèi)主要經(jīng)CYP3A5代謝生成活性代謝產(chǎn)物AR-C124910XX，并經(jīng)CYP3A4催化生成AR-C133913XX，而在大鼠體內(nèi)CYP3A1/CYP3A2為人體內(nèi)CYP3A4/CYP3A5的同工酶。因此，筆者測定了連續(xù)7 d灌胃給予復(fù)方丹參膠囊后兩組大鼠CYP3A1及CYP3A2 mRNA表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP3A2 mRNA表達顯著升高。進一步檢測CYP3A2蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟中CYP3A2表達顯著升高，提示大鼠體內(nèi)替格瑞洛暴露量的降低可能是因為復(fù)方丹參膠囊誘導(dǎo)肝臟CYP3A2表達，從而使其代謝增多。這與ZHOU等[17]的研究結(jié)果相似，他們發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參膠囊可誘導(dǎo)CYP3A，導(dǎo)致氯吡格雷體內(nèi)暴露量減少。本研究結(jié)果表明，連續(xù)7 d灌胃給予復(fù)方丹參膠囊后可使大鼠體內(nèi)替格瑞洛的暴露量降低，清除率加快，但半衰期無顯著性變化。由藥動學(xué)結(jié)果可知，復(fù)方丹參膠囊可致大鼠體內(nèi)替格瑞洛清除率增加，表觀分布容積也增加，而半衰期無顯著性變化，其原因可能與復(fù)方丹參膠囊可調(diào)控大鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)運體活性有關(guān)。

研究結(jié)果表明，連續(xù)7 d灌胃給予復(fù)方丹參膠囊(90 mg·kg-1)后大鼠肝臟的CYP3A2 mRNA及蛋白表達水平均顯著升高。筆者進一步探索了復(fù)方丹參膠囊對CYP3A酶活性的影響。為進一步觀察CYP3A活性表達水平，分別將對照組及復(fù)方丹參膠囊組(90 mg·kg-1)大鼠處死制備肝微粒體，采用肝微粒體孵育體系測定CYP3A活性，所選用復(fù)方丹參膠囊的劑量與臨床使用劑量等效。結(jié)果顯示，復(fù)方丹參膠囊組CYP3A探針底物MDZ的代謝消除率顯著增加，說明復(fù)方丹參膠囊可顯著升高CYP3A 酶活性，也進一步驗證了復(fù)方丹參膠囊可誘導(dǎo)CYP3A2酶表達活性，這與部分文獻報道一致[21-22]。但是，WANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)丹參提取物對CYP3A表達無影響，且WANG等[23]發(fā)現(xiàn)隱丹參酮可抑制CYP3A活性，其原因可能與所采用的濃度不同有關(guān)。復(fù)方丹參膠囊主要由丹參、三七、冰片經(jīng)提取精制而成，其中丹參的主要活性成分為丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ等；三七的主要活性成分為人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1等皂苷類化合物[14，24]。馬靜等[25]研究報道隱丹參酮、丹參酮ⅡA可誘導(dǎo)人肝HepG2細胞CYP3A4酶活性及蛋白的表達。陳艷進等[26]發(fā)現(xiàn)三七總皂苷等可顯著誘導(dǎo)CYP3A mRNA表達。因此，復(fù)方丹參膠囊誘導(dǎo)大鼠體內(nèi)CYP3A酶可能主要與隱丹參酮、丹參酮ⅡA、三七皂苷可誘導(dǎo)大鼠CYP3A活性與表達有關(guān)。

表2 替格瑞洛在大鼠體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù)

①與對照組比較，P<0.05。

①與對照組比較，P<0.05。

表3 兩組大鼠肝微粒體MDZ的消除率

綜上所述，本研究證實了連續(xù)灌胃給予大鼠復(fù)方丹參膠囊可顯著降低其體內(nèi)替格瑞洛的暴露量，其作用機制可能與誘導(dǎo)CYP3A2活性及蛋白表達有關(guān)。故在臨床合用時應(yīng)關(guān)注此問題，及時監(jiān)測替格瑞洛的血藥濃度以達到最佳治療效果。此外，筆者將進一步選用健康志愿進行臨床試驗來驗證復(fù)方丹參膠囊與替格瑞洛藥動學(xué)/藥效學(xué)的相互作用，以期為替格瑞洛的臨床合理應(yīng)用奠定理論和實驗基礎(chǔ)。