劉 露， 吳文睿*， 方頌平， 蒲順昌， 丁 斌，邢 爽， 劉開(kāi)放， 董書(shū)甲， 董 琪， 劉飛翔

(1.亳州學(xué)院，生物與食品工程系，安徽 亳州 236800；2.養(yǎng)生型配制酒亳州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 亳州 236800)

雙酚 A 為環(huán)境激素類(lèi)物質(zhì)由于具有與雌激素相類(lèi)似的作用。雙酚A能由食物鏈進(jìn)入生物體內(nèi)并與雌激素受體相互作用,干擾正常激素在機(jī)體內(nèi)的產(chǎn)生、釋放、運(yùn)輸、代謝等作用,從而影響生物的生殖、免疫神經(jīng)等功能,因此對(duì)生物體具有較強(qiáng)的致畸性、致突變性和致癌性,已經(jīng)被歐盟一些國(guó)家列入優(yōu)先污染物的黑名單。作為一種重要的精細(xì)化工原料,雙酚A 主要用于生產(chǎn)多種高分子材料,還可用作聚氯乙烯熱穩(wěn)定劑、橡膠防老劑、農(nóng)用殺蟲(chóng)劑、增塑劑等;在醫(yī)藥方面,可以被用作殺真菌藥物。另外,雙酚A廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)罐頭內(nèi)包裝、食品包裝材料、牙科填充劑、嬰兒用品等塑料行業(yè),并不斷開(kāi)發(fā)新的用途。由于雙酚A的應(yīng)用范圍有逐漸拓寬的趨勢(shì),因此將隨著生產(chǎn)及使用過(guò)程逐漸進(jìn)入環(huán)境,危害人類(lèi)的健康。食品包裝材料的衛(wèi)生安全是食品安全的一個(gè)重要方面,環(huán)境激素類(lèi)化合物從食品包裝材料向食品中的遷移是污染食品的重要途徑之一。作為一種典型的環(huán)境激素類(lèi)化合物,雙酚A不僅在罐頭殺菌過(guò)程中會(huì)生成雙酚-A-二環(huán)氧甘油醚,還可以通過(guò)食品包裝材料進(jìn)入食品或飲料中,進(jìn)而進(jìn)入人體造成人類(lèi)和野生動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)異常,還會(huì)嚴(yán)重干擾人類(lèi)和動(dòng)物的生殖遺傳功能。雙酚S是雙酚A的替代物,同樣存在毒性。雙酚A在結(jié)構(gòu)上與雙酚S具有相似性,由于其在奶瓶、食品接觸材料中的使用,在油脂、酸或外界環(huán)境的影響下,可能會(huì)遷移到食品或飲料中,然后被人體吸收,是導(dǎo)致人體暴露于雙酚S的一種主要途徑。白酒本身不會(huì)產(chǎn)生雙酚A及雙酚S,但其包裝內(nèi)塞使用了塑料材料,可能會(huì)造成雙酚A或雙酚S遷移至酒體中。雙酚類(lèi)化合物的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC、氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)和液相色譜質(zhì)譜法(LC-MS)等。本研究建立的同位素內(nèi)標(biāo)-UPLC-MS/MS法,能同時(shí)對(duì)白酒內(nèi)塞中遷移出的雙酚A及雙酚S進(jìn)行定性定量,對(duì)白酒產(chǎn)品中中雙酚A及雙酚S的監(jiān)控提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司);色譜柱:Waters UPLC C(1.7 μm,2.1×50 mm);0.22 μm針式過(guò)濾器(天津津騰);電子天平:0.1 mg(梅特勒公司);超純水機(jī)(密理博);小型渦旋振蕩器(北京優(yōu)晟UVS-1)。

雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品(Dr,0.25 g),雙酚S標(biāo)準(zhǔn)品(Dr,100 mg),雙酚A內(nèi)標(biāo):雙酚A-13C12(TRC,2.5 mg),雙酚S內(nèi)標(biāo):雙酚S-13C12(TRC,1 mg),市售白酒內(nèi)塞,乙腈(色譜純),乙醇(色譜純)。

1.2 方法

1.2.1 遷移實(shí)驗(yàn) 本遷移實(shí)驗(yàn)為內(nèi)塞雙酚A及雙酚S遷移實(shí)驗(yàn),取內(nèi)塞(0.5 mm<厚度<2 mm)剪成規(guī)則的長(zhǎng)方形計(jì)算其面積并稱量其質(zhì)量,依據(jù) GB 31604.1-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)通則》對(duì)食品模擬物選擇的規(guī)定中的浸泡方法進(jìn)行面積和質(zhì)量比換算,最終浸泡實(shí)驗(yàn)按照0.12 dm瓶塞接觸10 mL的50度酒樣開(kāi)展,是國(guó)標(biāo)中要求接觸面積的2倍。本遷移實(shí)驗(yàn)共排查瓶塞10種。在40 ℃下共追蹤檢測(cè)雙酚A及雙酚S遷移量150 d。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別稱取100.0 mg雙酚A及雙酚S標(biāo)準(zhǔn)品,用50%乙醇溶解,完全溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,得到濃度為1 000.0 mg/L雙酚A及雙酚S標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,取雙酚A及雙酚S標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各一半配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,得到500.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,并逐級(jí)稀釋得到適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別稱取2.5 mg雙酚A-13C12及1.0 mg雙酚S-13C12標(biāo)準(zhǔn)品,用50%乙醇溶解,并分別定容至50 mL及100 mL容量瓶中,分別得到50.0 mg/L的雙酚A-13C12及10.0 mg/L的雙酚S-13C12標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,并稀釋得到雙酚A-13C12及雙酚S-13C12質(zhì)量濃度為40 μg/L和8 μg/L的混合工作液。雙酚A及雙酚S標(biāo)準(zhǔn)溶液配制濃度見(jiàn)表1。標(biāo)準(zhǔn)溶液的處理方法為分別取表1中濃度梯度的雙酚A及雙酚S的混合工作液1 mL于進(jìn)樣瓶中,之后分別加入濃度為40 μg/L和8 μg/L 的100 μL的雙酚A-13C12及雙酚S-13C12混合內(nèi)標(biāo),進(jìn)樣瓶放在渦旋振蕩器上混勻樣品,待進(jìn)樣。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制溶劑均為50%乙醇。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度

1.2.3 色譜條件 色譜柱:BEH C18柱,1.7 μm,2.1×50 mm;柱溫:30 ℃,進(jìn)樣量2 μL;流動(dòng)相:水-乙腈,流速0.4 mL/min,流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表2。其中A為乙腈,B為超純水。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.2.4 質(zhì)譜條件 本實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜條件采用電噴霧負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,其他質(zhì)譜條件見(jiàn)表3。

表3 質(zhì)譜條件

1.2.5 遷移實(shí)驗(yàn)樣品的前處理方式 取5 mL遷移實(shí)驗(yàn)酒樣過(guò)0.22 μm濾膜后,取1 mL于進(jìn)樣瓶中,之后加入100 μL的雙酚A-13C12及雙酚S-13C12內(nèi)標(biāo),進(jìn)樣瓶放在渦旋振蕩器上混勻樣品,待進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析

雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品及雙酚A內(nèi)標(biāo)，以及雙酚S標(biāo)準(zhǔn)品及雙酚S內(nèi)標(biāo)色譜圖結(jié)果見(jiàn)圖1～2。

圖1 雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品及雙酚A內(nèi)標(biāo)色譜圖

圖2 雙酚S標(biāo)準(zhǔn)品及雙酚S內(nèi)標(biāo)色譜圖

由圖1～2可知,雙酚A和其內(nèi)標(biāo)的的保留時(shí)間一致,均為1.88 min,雙酚S和其內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間一致,均為1.13 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照表1中的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度梯度配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,雙酚A及雙酚S的濃度梯度分別為10、50、100、200、500 μg/L,以雙酚A及雙酚S的濃度與峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3～4,線性回歸方程及

R

見(jiàn)表4。

表4 雙酚A和雙酚S線性回歸方程及R2

圖3 雙酚A標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 雙酚S標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 檢測(cè)方法的驗(yàn)證

2.3.1 方法精密度測(cè)試

2.3.1.1 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一種白酒加標(biāo)樣品進(jìn)行6次檢測(cè),雙酚A及雙酚S的含量結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

由表5可以看出,雙酚A及雙酚S的精密度試驗(yàn)RSD分別為3.03%和4.79%?；痉戏治龇椒ㄒ蟆?/p>

2.3.1.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 對(duì)6個(gè)相同加標(biāo)量下的白酒加標(biāo)樣品分別進(jìn)行檢測(cè),雙酚A及雙酚S的含量結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品重現(xiàn)性測(cè)試結(jié)果

由表6可以看出,雙酚A及雙酚S的精密度試驗(yàn)RSD分別為3.87%和5.06%?；痉戏治龇椒ㄒ?。

2.3.2 方法加標(biāo)回收率

加標(biāo)回收率測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表7可以看出,雙酚A及雙酚S的3個(gè)加標(biāo)量下的加標(biāo)回收率在87.70%～115.75%之間,符合分析方法要求。

2.4 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 雙酚A遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 雙酚A遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 雙酚A遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表8可以看出,部分內(nèi)塞遷移實(shí)驗(yàn)中有雙酚A檢出,按遷移時(shí)間(7、14、21、28、60、120、150 d)分7次對(duì)遷移實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè),隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng),其中有5種內(nèi)塞雙酚A遷移量增高,到浸泡150 d時(shí)已經(jīng)趨于平穩(wěn),最高含量為22.4 μg/kg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)的限量標(biāo)準(zhǔn)(中國(guó)2016年的GB 9685-2016標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定,雙酚A用于食品接觸塑料、涂層時(shí),其特定遷移量應(yīng)不超過(guò) 600 μg/kg。另外5種白酒包裝內(nèi)塞中無(wú)雙酚A檢出。

2.4.2 雙酚S遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果 雙酚S遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 雙酚S遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表9可以看出,所有白酒包裝內(nèi)塞遷移實(shí)驗(yàn)樣品中均無(wú)雙酚S檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了一種白酒包裝內(nèi)塞中雙酚A及雙酚S的同位素內(nèi)標(biāo)-UPLC-MS/MS法檢測(cè)方法,并按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31604.1-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)通則》開(kāi)展浸泡遷移實(shí)驗(yàn),以評(píng)估白酒內(nèi)塞中的雙酚A及雙酚S引入酒體的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果表明,僅部分內(nèi)塞中有雙酚A檢出,最高量為22.4 μg/kg,遷移量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)的限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,所有內(nèi)塞遷移實(shí)驗(yàn)中均無(wú)雙酚S檢出。由此可以看出白酒包裝內(nèi)塞中的雙酚A及雙酚S引入酒體的風(fēng)險(xiǎn)較小。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)了白酒包裝內(nèi)塞中雙酚A及雙酚S遷移量的檢測(cè)方法,方法簡(jiǎn)單高效,7 min以內(nèi)可以完成雙酚A及雙酚S的檢測(cè),并開(kāi)展了包裝內(nèi)塞浸泡遷移實(shí)驗(yàn),可為白酒包裝內(nèi)塞中雙酚A及雙酚S遷移至酒體的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供一定參考。