辛鵬飛，高雪，康富貴，張琛涵，柴琛，張建剛

（蘭州大學，1.第一臨床醫(yī)學院，2.基礎醫(yī)學院；3.蘭州大學第一醫(yī)院 普外科，甘肅 蘭州 730000；4.蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院 普外科，江蘇 蘇州 215100）

肝纖維化是大多數(shù)慢性肝病的主要結局，包括病毒性肝炎、酒精性脂肪性肝炎、代謝性疾病、藥物毒素等，長期暴露于損傷環(huán)境可導致纖維化進展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化，雖然可以針對病因進行治療，但我們?nèi)匀蝗鄙倏估w維化治療的有效手段。尤其近年來非酒精性脂肪性肝炎導致的肝纖維化更加普遍，因此研究肝纖維化的機制至關重要。研究表明肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSCs）是體內(nèi)肝纖維化的關鍵因素，與潛在的疾病無關[1]。在肝損傷過程中，HSCs由靜止狀態(tài)激活并轉(zhuǎn)分化為增殖、收縮的肌成纖維細胞樣表型，引起細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過度沉積。異常的ECM也能通過Rho/ROCK（Rho associated coiled coil forming protein kinase，ROCK）信號通路刺激活化的HSCs遷移和增殖。在這篇綜述中，我們總結了活化的HSCs與Rho/ROCK信號通路有關的研究成果，以期為抗纖維化治療找到新的思路和方法。

1 HSCs的基本功能與活化

HSCs又稱貯脂細胞或Ito細胞，是一種非實質(zhì)細胞，在正常和損傷的肝臟中都有顯著的功能，最初由von Kupffer于1876年發(fā)現(xiàn)，位于肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞之間的Disse間隙內(nèi)，其數(shù)量約占肝臟細胞總數(shù)的10%，它們最顯著的特征是胞質(zhì)核周脂滴的存在，這些脂滴富含視黃醇酯[2]。在正常肝臟中，HSCs保持靜止、非增殖的表型，主要參與肝臟的穩(wěn)態(tài)功能，包括發(fā)育和再生、免疫調(diào)節(jié)、維生素A代謝、細胞因子和生長因子的分泌、脂質(zhì)代謝和藥物解毒[3]。除了這些關鍵作用外，HSCs還協(xié)調(diào)一個復雜的細胞調(diào)控網(wǎng)絡[4]。

在損傷或炎癥性肝組織微環(huán)境中，多種細胞因子以及肝外因素均可直接或間接誘導HSCs活化，其激活方式具有獨立性和特異性[5]?；罨腍SCs轉(zhuǎn)分化是肌成纖維細胞的主要細胞來源，是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)[6]。自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、氧化應激、脂質(zhì)代謝和受體介導信號在內(nèi)的多種途徑揭示了HSCs活化的復雜性[5，7]。HSCs的活化過程大致可分為早期啟動、后期持續(xù)2個階段，是一個多細胞、多分子、多途徑參與的過程[8]。如果HSCs的活化和增殖被抑制，或凋亡增加，則肝纖維化的進展可以被抑制或逆轉(zhuǎn)[9]。功能研究表明多種信號通路和其他機制失調(diào)使HSCs永久活化，目前比較認同的是信號通路機制，HSCs的活化有多條信號通路調(diào)節(jié)，其中Rho/ROCK信號通路在HSCs活化、增殖及遷移過程中的作用已經(jīng)受到廣泛關注。

2 Rho/ROCK信號通路的功能機制

Rho/ROCK信號通路可以被多種細胞因子和炎癥介質(zhì)激活，包括血小板源性生長因子（PDGF）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等[10]。這些細胞因子和炎癥介質(zhì)是肝損傷和肝纖維化過程中產(chǎn)生的重要物質(zhì)，在肝纖維化過程中均存在Rho/ROCK信號通路的關鍵分子的激活和表達，提示Rho/ROCK信號通路可能被炎癥介質(zhì)激活后參與肝纖維化的病理生理過程。Rho GTP酶和ROCK是Rho/ROCK通路的主要信號分子，Rho/ROCK信號通路激活后Rho與GTP結合形成Rho GTP酶，成為活化狀態(tài)，將信號傳遞給下游效應分子ROCK使之激活，從而調(diào)控細胞的多種生物學行為[11]。

2.1 小G蛋白Rho家族及調(diào)節(jié)

Rho GTP酶家族是Ras超家族的成員，到目前為止已發(fā)現(xiàn)約20個成員，基于序列同源性和功能，被細分為5個亞家族[12]，Rho亞家族是其中之一。Rho蛋白存在于所有真核生物物種中，并且高度保守[13]。大多數(shù)Rho家族蛋白同Ras超家族的成員一樣，在活性型（GTP結合態(tài)）和失活型（GDP結合態(tài)）構象之間循環(huán)，充當調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導途徑的分子開關[14]。在GTP結合態(tài)時能夠與效應分子相互作用，啟動下游反應，而內(nèi)在的GTP酶活性使蛋白回到GDP結合態(tài)時，完成循環(huán)并終止信號轉(zhuǎn)導過程。在哺乳動物細胞中，調(diào)節(jié)這個循環(huán)過程需要3類重要分子[15]：（1）鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchanging factors，GEFs），是催化GDP釋放和Rho與GTP結合，活化Rho GTP酶。（2）GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein，GAP），作為負向調(diào)節(jié)因子加速Rho GTP酶的水解，使之由活性狀態(tài)變?yōu)闊o活性狀態(tài)；（3）GDP解離抑制因子（GDP dissociation inhibitor，GDI），能夠阻止GDP從Rho GTP酶上分離，從而抑制酶的活性。

2.2 Rho/ROCK信號通路的激活

Rho GTP酶是真核細胞內(nèi)一類重要的信號轉(zhuǎn)導分子，是許多膜表面受體的下游效應蛋白，目前的研究發(fā)現(xiàn)Integrin受體家族、IgG受體超家族以及鈣黏著蛋白受體家族等可以將多種細胞外信號包括可溶性信號分子（生長因子、細胞因子、各類激素等）、黏附接觸、機械應力跨膜轉(zhuǎn)導作用于Rho蛋白使其激活，調(diào)節(jié)不同的細胞反應[16]。Rho蛋白不僅能對來自上游不同受體所介導的信號作出反應，而且它們內(nèi)部之間以及與其他小G蛋白家族如Ras之間相互影響，還可以作用于下游效應器，產(chǎn)生不同的生物學效應[17]。Rho GTP酶的下游靶點識別并不簡單，因為大多數(shù)不包含可識別的保守域，目前已經(jīng)報道了Rho家族成員的100多個靶點，包括大約30種激酶和很多支架/銜接蛋白[14]。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是最典型的Rho效應器之一，在各種細胞和生物學功能中起著核心作用[18]。ROCK分布于全身組織，主要存在兩種亞型：ROKα（ROCK2）和p160 ROCK（ROKβ或ROCK1），ROCK1在非神經(jīng)組織以及肝、肺、脾和睪丸中表達更高，而ROCK2在腦、心臟和肌肉中富集[19]。研究表明，ROCK1與應力纖維形成有關，而ROCK2在吞噬和細胞收縮中起關鍵作用[20]。

3 Rho/ROCK信號通路對HSCs活化的調(diào)控

Rho/ROCK信號通路可介導多種器官的間質(zhì)纖維化，也是調(diào)節(jié)肝纖維化中HSCs活化增殖和收縮的主要信號通路。有研究表明RhoA在活化的HSCs中表達，并且Rho/ROCK信號通路調(diào)控HSCs活化相關的細胞形態(tài)改變[21]。ROCK是Rho下游關鍵效應分子，能接受Rho傳遞的信號，激活ROCK使多個氨基酸位點發(fā)生磷酸化，并介導下游一系列的磷酸化與脫磷酸化反應，產(chǎn)生多種細胞學效應，包括HSCs的收縮、遷移、增殖以及活化等[22]。

TGF-β和PDGF是促進HSCs活化和增殖的兩種主要細胞因子。TGF-β1主要與膜特異性受體結合，通過SMADs蛋白（SMAD2和SMAD3）激活細胞內(nèi)信號刺激靶基因的轉(zhuǎn)錄活性[23]。Rho/ROCK信號通路與PDGF、ET-1和TGF-β1/Smad等多條通路存在交匯，通過調(diào)節(jié)基因和蛋白的表達，在細胞增殖、遷移和凋亡等多種生理和病理過程中起關鍵作用[24]。TGF-β1是Rho/ROCK信號通路的上游激活因素，有研究表明，RhoA在TGF-β1誘導的HSCs遷移中起著關鍵作用[25]，采用不同濃度的TGF-β1刺激靜息的HSCs，可檢測到Rho/ROCK信號通路中RhoA和Cdc42的表達增加，HSCs表現(xiàn)為偽足及應力纖維增多，通過激光共聚焦顯微鏡觀察到細胞遷移及骨架改變，進一步說明了TGF-β1激活Rho影響HSCs的活化和遷移。此外，還有研究證實了在人肝星狀細胞株（LX-2）中TGF-β1激活ROCK和Smad通路，誘導TGFβ-2和ET-1的表達，從而促進HSCs活化和纖維化的進展[26]。PDGF是肝纖維化的主要參與者，介導HSCs增殖和ECM沉積[27]。內(nèi)皮抑素通過調(diào)節(jié)Rho/ROCK信號通路抑制PDGF-BB或TGF-β1誘導的HSCs活化和增殖[10]。還有研究表明，局部粘著斑激酶（FAK）能通過Rho增強PDGF-BB誘導的HSCs遷移，證實了Rho/ROCK信號通路可能是HSCs遷移和增殖的關鍵途徑[28]。

Rho/ROCK信號通路還可以激活整合素相關通路，整合素是一種細胞表面的跨膜糖蛋白受體，在介導細胞和ECM之間的相互作用和調(diào)節(jié)多種細胞功能中發(fā)揮重要作用。HSCs表達整合素α1β1、α2β1、αvβ1、αvβ3、α6β4等，用siRNA沉默αvβ3或阻斷該受體的信號通路均可誘導HSCs凋亡[29-30]。有研究證實Ang II也能增強肝星狀細胞系（LI90）中MCP-1和RhoA的mRNA表達水平，并誘導MCP-1的分泌，這表明Ang II至少部分是由Rho/ROCK信號通路介導HSCs產(chǎn)生MCP-1調(diào)節(jié)肝臟炎癥[31]。張小蘭等[32]研究也發(fā)現(xiàn)，Ang II可使MLC蛋白磷酸化水平發(fā)生變化，Ang II處理組Rock2、RhoA GTP、Rho GEF的mRNA表達水平均顯著高于對照組，說明Ang II可通過ROCK介導不依賴Ca2+的通路誘導HSCs收縮。Rho、ROCK及其家族蛋白，包括Rac1可促進活性氧（ROS）的產(chǎn)生并增強HSCs的收縮性[33]。還有研究揭示了p75神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（p75NTR）在HSCs活化中的作用，并表明甲狀腺激素通過增加p75NTR表達，激活Rho和誘導α-SMA等途徑促進HSCs的活化[34]。

近年來，microRNAs（miRNAs）基于其在多個生化途徑中的重要功能，在肝纖維化中的調(diào)節(jié)已經(jīng)被廣泛研究，特別是在HSCs中，認為miRNAs對細胞活化和轉(zhuǎn)分化具有重要的調(diào)控作用[35-36]。研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化和體外培養(yǎng)激活過程中miRNA-125b在HSCs中上調(diào)，在HSCs中過表達miRNA-125b通過直接靶向作用于Stard13結構域增強RhoA活性，而miRNA-125b敲低則抑制RhoA激活，抑制RhoA或其下游分子可減弱miRNA-125b誘導的HSCs內(nèi)α-SMA表達和細胞收縮[37]。此外，在HSCs活化過程中觀察到自噬水平增加，抑制自噬會抑制HSCs的活化和增殖[38]。有研究表明在體外PDGF及其下游分子SHP2抑制自噬，刺激HSCs釋放胞外囊泡（EVs），PDGF和SHP2通過調(diào)控mTOR（雷帕霉素靶蛋白）信號分子，激活ROCK1和抑制自噬來誘導微泡和外泌體的釋放，從而促進HSCs的活化和遷移[39]。

4 Rho/ROCK通路抑制劑及其對HSCs的影響

Rho/ROCK信號通路與HSCs的各種反應密切相關，其激活可以促進HSCs活化，但應用Rho/ROCK信號通路抑制劑，可以抑制ROCK活化及其所介導的下游磷酸化反應，從而抑制HSCs活化。

Y-27632和法舒地爾是兩種主要的小分子ROCK抑制劑，它們在研究中被廣泛使用。研究表明在HSCs中Y-27632能抑制RhoA誘導的應力纖維的形成，還能抑制FAK和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶的磷酸化阻斷細胞遷移和增殖[40]。法舒地爾是Rho/ROCK通路的另一種特異性抑制劑，有研究表明在HSCs中法舒地爾抑制膠原蛋白的產(chǎn)生并且增強膠原酶活性，并抑制細胞伸展、應力纖維形成及細胞生長[41]。王玉珍等[42]研究也證實法舒地爾通過抑制Rho/ROCK信號通路對細胞骨架的調(diào)節(jié)作用，抑制HSCs的黏附、遷移和增殖。C3是一種Rho的抑制劑，在培養(yǎng)的HSCs中能增強組蛋白相關DNA片段和caspase 3活性，提示抑制Rho/ROCK通路可導致HSCs凋亡，減少肝纖維化的發(fā)生[22，43]。研究發(fā)現(xiàn)莪術醇和丹參素等中藥及其提取物也能通過阻斷Rho/ROCK信號通路抑制HSCs的增殖收縮，延緩肝纖維化的進展[21，44]。還有研究表明腺苷在HSCs中以誘導肌動蛋白應力纖維丟失的方式抑制Rho/ROCK信號通路，是Rho通路的生理抑制劑，具有包括抑制HSCs收縮在內(nèi)的多種功能[45]。

考慮到Rho/ROCK通路的多效性，即使是選擇性抑制劑也可能損害正常的細胞功能，因此新的抑制劑正在開發(fā)并在體內(nèi)驗證。通過載體將抑制劑靶向作用于HSCs能有效抑制肝纖維化，使用藥物載體pPBMSA將抑制劑Y27632靶向作用于活化的HSCs可以阻止其遷移、收縮，該載體由小鼠血清白蛋白（MSA）共價偶聯(lián)到PDGF蛋白識別部分（pPB）組成[46]。研究發(fā)現(xiàn)焦磷酸合成酶（GGPPS）的表達在小鼠纖維化肝臟的HSCs中顯著增加，GGPPS通過Rho/ROCK通路介導HSCs活化，使用攜帶siRNA-GGPPS的維生素A耦合脂質(zhì)體特異性敲低GGPPS降低了HSCs活化[47]。此外，維生素A耦合脂質(zhì)體ROCK抑制劑抑制LX-2細胞的活化，導致α-SMA和TGF-β1顯著降低[48]。

5 小結與展望

HSCs活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，多種細胞、介質(zhì)和信號通路共同作用于HSCs活化、增殖和遷移的各個環(huán)節(jié)。我們對HSCs活化的研究正在擴展，特別是以前與HSCs生物學無關的分子和途徑有可能成為關鍵角色，但它們對治療策略的影響尚不清楚，通過探究HSCs的活化機制，針對關鍵的信號通路將是開發(fā)有效的治療肝纖維化的新方法。Rho/ROCK信號通路通過調(diào)控HSCs活化、增殖、遷移與基質(zhì)代謝參與了肝纖維化的形成，抑制Rho/ROCK通路可以抑制HSCs的活化，延緩肝纖維化的進展，為肝纖維化的治療提供了理論基礎和新的靶點，對進一步闡述肝纖維化的形成機制具有重要意義。總體而言，開發(fā)新療法最可能的領域是纖維化的逆轉(zhuǎn)，誘導活化的HSCs失活、衰老和凋亡可能是一種可行的方法，但肝纖維化是一個復雜的動態(tài)過程，HSCs的活化更是受到不同信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控，因此只針對一個信號通路可能不足以逆轉(zhuǎn)纖維化。我們還需要更深入的研究HSCs的活化機制，將基礎實驗研究的成果轉(zhuǎn)化為臨床治療纖維化的策略，為肝纖維化治療提供更多行之有效的方法。