腫瘤耐藥的細(xì)胞可塑性機(jī)制及啟示

李 玲

(空軍軍醫(yī)大學(xué)國(guó)家分子醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化中心，陜西 西安 710032)

1 腫瘤細(xì)胞耐藥性的非遺傳適應(yīng)性機(jī)制

近20年，隨著小分子靶向藥物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑在臨床實(shí)踐中的相繼應(yīng)用，癌癥患者的生存預(yù)后得到了極大改善。然而，與傳統(tǒng)化療藥物或放射治療類似，這些藥物只對(duì)少部分患者有效，對(duì)大多數(shù)患者尤其是進(jìn)展期或已有轉(zhuǎn)移灶的患者而言，療效并不理想，往往出現(xiàn)對(duì)藥物的抵抗性，甚至復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。因而，腫瘤細(xì)胞對(duì)治療藥物的抵抗性即腫瘤細(xì)胞的耐藥性一直是臨床中亟待解決的難題。

長(zhǎng)久以來，人們認(rèn)為腫瘤細(xì)胞耐藥性的根源在于基因的遺傳進(jìn)化(genetic evolution)，即腫瘤細(xì)胞通過產(chǎn)生基因突變、擴(kuò)增、缺失或染色體易位等改變，導(dǎo)致靶蛋白突變無法結(jié)合藥物、激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游效應(yīng)分子或替代生存信號(hào)，進(jìn)而逃逸放化療、靶向治療或免疫治療的殺傷作用并繼續(xù)存活增殖[1-2]。上述基因改變可能原先就存在于少數(shù)腫瘤細(xì)胞比如腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)中，成為引起先天性耐藥的根源；也可能在接受藥物治療的過程中后天產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致獲得性耐藥[1]。與此相對(duì)應(yīng)，基于測(cè)序技術(shù)的腫瘤基因組學(xué)數(shù)據(jù)不斷積累，一方面為腫瘤治療靶標(biāo)篩選和臨床結(jié)果預(yù)測(cè)提供新思路，同時(shí)也導(dǎo)致個(gè)體化/精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的興起。然而，常規(guī)測(cè)序技術(shù)由于測(cè)序深度的限制，只能檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞群體中的顯性突變克隆，新近高分辨率單細(xì)胞測(cè)序的結(jié)果表明，在癌癥克隆進(jìn)化中出現(xiàn)的所有突變細(xì)胞克隆在癌癥起始階段可能就存在，只是程度不同[2]，提示基因的遺傳進(jìn)化并非唯一或事實(shí)上最常見的治療性抵抗機(jī)制。面對(duì)治療藥物的應(yīng)激壓力，腫瘤細(xì)胞可能通過非基因改變的方式，通過細(xì)胞的適應(yīng)性改變，產(chǎn)生治療耐受性或抵抗性；前者指腫瘤細(xì)胞暫時(shí)存活下來并維持在增殖靜止?fàn)顟B(tài)成為慢周期細(xì)胞(slow-cycling cells)，臨床上稱為微小殘余病灶(minimal residual disease,MRD)；后者指腫瘤細(xì)胞不僅存活下來并可在藥物存在的條件下進(jìn)入增殖狀態(tài)。目前認(rèn)為，這種非遺傳的適應(yīng)性(non-genetic adaptive)改變，可能是腫瘤細(xì)胞耐藥性具有普遍性的共性機(jī)制，已成為近年來腫瘤耐藥性研究的新熱點(diǎn)和新挑戰(zhàn)。

從概念上講，適應(yīng)性反應(yīng)(adaptive response)是指腫瘤細(xì)胞在對(duì)抗藥物壓力并生存增殖時(shí)，通過基因表達(dá)和表觀遺傳學(xué)的改變，將自身塑造成更加耐受或抵抗治療的狀態(tài)或表型的現(xiàn)象。通常，這一反應(yīng)是暫時(shí)、可逆的，獲得的特征不能穩(wěn)定地遺傳給子代細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞耐藥性的非遺傳適應(yīng)性機(jī)制主要涉及腫瘤細(xì)胞本身的適應(yīng)性改變?nèi)缂?xì)胞狀態(tài)或表型可塑性，以及腫瘤微環(huán)境的適應(yīng)性改變。后者是指藥物直接、或通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分泌細(xì)胞因子間接影響微環(huán)境中的間質(zhì)或免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞對(duì)治療藥物的抵抗性[3-4]。本文將重點(diǎn)探討腫瘤細(xì)胞本身的適應(yīng)性改變，即藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞可塑性。

2 藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞可塑性現(xiàn)象

在抗癌藥物壓力下，腫瘤細(xì)胞具有的進(jìn)行適應(yīng)性狀態(tài)或表型轉(zhuǎn)換的能力稱細(xì)胞可塑性(cell plasticity)[1,5]。腫瘤細(xì)胞的可塑性特性使其能夠在面對(duì)藥物殺傷作用時(shí)轉(zhuǎn)化為耐受或抵抗的細(xì)胞狀態(tài)或表型，因而不再依賴原先的藥物靶點(diǎn)與通路，得以逃逸藥物的攻擊。2011年，Sequist，等[6]找到了細(xì)胞可塑性介導(dǎo)藥物治療抵抗性的首個(gè)臨床證據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)少數(shù)非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制劑的治療表現(xiàn)為抵抗，相應(yīng)的患者腫瘤組織類型轉(zhuǎn)化成為了小細(xì)胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)，停藥后，患者又恢復(fù)了對(duì)EGFR抑制劑的敏感性。藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞可塑性的最常見現(xiàn)象是上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)。此外，譜系轉(zhuǎn)分化、增殖-侵襲表型轉(zhuǎn)換亦是細(xì)胞可塑性的表現(xiàn)。

EMT一直被認(rèn)為是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵步驟，然而新近研究發(fā)現(xiàn)，其與腫瘤細(xì)胞的耐藥性關(guān)系更為密切，并且EMT相關(guān)的耐藥性可能先于EMT引起的侵襲轉(zhuǎn)移。例如，EGFR抑制劑獲得性耐藥的肺癌患者活檢組織標(biāo)本中，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子波形蛋白(Vimentin)表達(dá)增加，上皮細(xì)胞標(biāo)志分子上皮鈣黏著蛋白(E-cadherin)表達(dá)缺失[1]，采用表觀遺傳修飾藥物JMF3086誘導(dǎo)EMT，肺癌細(xì)胞出現(xiàn)對(duì)EGFR抑制劑的耐藥性[7]。盡管EMT促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的機(jī)制目前尚不明確，但現(xiàn)有研究均證實(shí)EMT是腫瘤細(xì)胞獲得耐藥性的重要原因，這也充分證明了細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換對(duì)于腫瘤細(xì)胞耐藥性的關(guān)鍵作用。

譜系轉(zhuǎn)分化是指不需經(jīng)歷祖細(xì)胞分化階段、由一種已分化細(xì)胞類型直接轉(zhuǎn)化為另一種細(xì)胞類型的細(xì)胞分化過程。藥物誘導(dǎo)可塑性現(xiàn)象中，常見的譜系轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象是神經(jīng)-內(nèi)分泌轉(zhuǎn)分化與皮膚-上皮轉(zhuǎn)分化。例如，25%去勢(shì)抵抗的前列腺癌細(xì)胞可發(fā)生雄激素受體(androgen receptor，AR)非依賴的細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)分化，出現(xiàn)神經(jīng)-內(nèi)分泌亞型，表現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌的組織學(xué)和分子特征，如AR信號(hào)低，TP53和RB1丟失，出現(xiàn)嗜鉻粒蛋白A和突觸蛋白表達(dá)；因此前列腺癌細(xì)胞減少對(duì)AR信號(hào)的依賴，逃逸去勢(shì)抵抗藥物的殺傷攻擊[8]。EGFR抑制劑耐藥的NSCLC患者中，約3%～14%轉(zhuǎn)分化為SCLC，發(fā)生神經(jīng)-內(nèi)分泌轉(zhuǎn)分化，且全基因組測(cè)序顯示轉(zhuǎn)分化前后肺癌細(xì)胞的EGFR突變類型相同，均為EGFRT790M，提示并非細(xì)胞突變引起的耐藥[9]。皮膚-上皮轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象方面，靶向藥物治療的基底細(xì)胞癌患者其部分細(xì)胞表型從轉(zhuǎn)錄鼓包樣轉(zhuǎn)變?yōu)閸{部/濾泡間表皮混合型，而在未治療的患者中該細(xì)胞類型不存在，表明其并非來自藥物治療引起的預(yù)先存在耐藥細(xì)胞群如CSCs的篩選富集[10]。

增殖-侵襲表型之間相互轉(zhuǎn)換的可塑性現(xiàn)象常見于黑色素瘤細(xì)胞。當(dāng)黑色素瘤患者接受絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路抑制劑治療時(shí)，黑色素瘤細(xì)胞可由增殖型轉(zhuǎn)換為浸潤(rùn)型或進(jìn)入未分化細(xì)胞狀態(tài)，引發(fā)治療的抵抗性[11-13]。在增殖-侵襲表型轉(zhuǎn)換過程中，耐藥性的獲得受到轉(zhuǎn)錄因子MITF表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，腫瘤細(xì)胞MITF表達(dá)丟失與未分化間充質(zhì)樣侵襲表型或神經(jīng)嵴干細(xì)胞表型的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)[14]。在胰腺癌，吉西他濱抵抗的腫瘤細(xì)胞其侵襲遷移能力增強(qiáng)，伴隨細(xì)胞狀態(tài)由增殖型向侵襲遷移型轉(zhuǎn)變[15]。

無論何種形式的細(xì)胞可塑性，均是在藥物治療后借助表觀遺傳和/或轉(zhuǎn)錄重編程過程，促使細(xì)胞狀態(tài)或表型向新的不同的狀態(tài)或表型轉(zhuǎn)換的結(jié)果，屬于腫瘤細(xì)胞對(duì)抗抗癌藥物的非遺傳適應(yīng)性反應(yīng)。鑒于腫瘤細(xì)胞可塑性在藥物治療耐受和抵抗過程中的關(guān)鍵作用，圍繞腫瘤細(xì)胞與抗癌藥物間“戰(zhàn)爭(zhēng)”亦即“隱藏(表型轉(zhuǎn)換)-尋找(癌癥治療)”的藥物誘導(dǎo)細(xì)胞可塑性機(jī)制成為腫瘤耐藥研究備受關(guān)注的焦點(diǎn)[1,16]。

3 藥物誘導(dǎo)細(xì)胞可塑性的DTPs藥物耐受機(jī)制

藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞可塑性的分子機(jī)制尚未完全闡明。但已經(jīng)明確的是，細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變是個(gè)逐步過渡的過程，均需經(jīng)歷一個(gè)“緩慢生長(zhǎng)”的藥物耐受階段。科研人員最先在NSCLC發(fā)現(xiàn)，藥物治療后即使病灶部分或完全緩解，部分腫瘤細(xì)胞仍能在藥物致死劑量暴露下短暫存活，這些MRD中幸存的藥物耐受細(xì)胞(drug-tolerant persisters，DTPs)暫時(shí)表現(xiàn)為緩慢增殖或不增殖狀態(tài)，藥物治療停止后則又恢復(fù)增殖活性和藥物敏感性[1,2,16-17]。反之，若藥物治療持續(xù)存在，DTPs則通過重編程甚至不可逆基因改變，成為穩(wěn)定或永久耐藥細(xì)胞。在結(jié)直腸癌[18]、黑色素瘤[19]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞[20]，研究人員也發(fā)現(xiàn)了DTPs的存在。在細(xì)胞狀態(tài)與表型轉(zhuǎn)換的過程中，DTPs的藥物耐受/休眠狀態(tài)允許細(xì)胞在被殺死和獲得突變的時(shí)間窗內(nèi)短暫生存，是將依賴表型的非遺傳適應(yīng)機(jī)制與依賴基因型的突變機(jī)制聯(lián)系起來的“橋梁”，且對(duì)獲得突變驅(qū)動(dòng)的耐藥、進(jìn)而進(jìn)化為臨床相關(guān)的耐藥至關(guān)重要。因此，DTPs藥物耐受機(jī)制被認(rèn)為可能是獨(dú)立于腫瘤類型、腫瘤治療方法之外的共性逃逸機(jī)制。

從細(xì)胞起源來看，DTPs緩慢分裂狀態(tài)與干細(xì)胞的特征相吻合，DTPs可能含有或就是腫瘤中預(yù)先存在的CSCs。由于CSCs固有的耐藥性包括內(nèi)在特性如高表達(dá)外排藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、處于靜止增殖期，及外在特性如可被微環(huán)境刺激因子激活的自我更新信號(hào)或/和EMT現(xiàn)象，CSCs可被藥物選擇富集，表現(xiàn)出治療的抵抗性，此即DTPs細(xì)胞起源的達(dá)爾文自然選擇學(xué)說[1,2,16,21]。體內(nèi)、外及臨床研究均證實(shí)藥物處理可篩選富集CSCs，且CSCs的先天耐藥性決定了DTPs的藥物耐受狀態(tài)，如紫杉醇處理的乳腺癌細(xì)胞[22]、吉西他濱處理的膀胱癌細(xì)胞[23-24]、卡鉑處理的卵巢癌細(xì)胞[25]等。運(yùn)用分子條形碼技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)CSCs的先天耐藥性源于其借用了胚胎發(fā)育的增強(qiáng)子轉(zhuǎn)換機(jī)制，即CSCs使用與譜系特異性分化細(xì)胞不同的增強(qiáng)子如前驅(qū)或輔助因子，通過轉(zhuǎn)錄選擇機(jī)制，維持細(xì)胞生存增殖所需關(guān)鍵基因如MYC的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物攻擊的抵抗性[26]。

在5-氟尿嘧啶處理的結(jié)腸癌細(xì)胞[27]、替莫唑胺處理的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞[28]、順鉑處理的肺癌細(xì)胞[29]，DTPs耐受藥物的機(jī)制則存在另一種可能性。如，在藥物治療等內(nèi)、外非遺傳信號(hào)的刺激誘導(dǎo)下，本身不具備腫瘤起始能力的DTPs通過轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳學(xué)修飾與代謝重編程等機(jī)制獲得CSCs表型特征，成為誘導(dǎo)性CSCs或耐藥性CSCs，并在藥物治療中持續(xù)補(bǔ)充CSCs，用以對(duì)抗治療藥物的殺傷攻擊，此即拉馬克誘導(dǎo)學(xué)說[1,2,16]。該學(xué)說強(qiáng)調(diào)了腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)藥物攻擊的主動(dòng)適應(yīng)性，又稱為治療觸發(fā)的適應(yīng)性(therapy-triggered“adaptation”)。支持此學(xué)說觀點(diǎn)的證據(jù)是：研究人員發(fā)現(xiàn)CSCs具有適應(yīng)環(huán)境信號(hào)改變的動(dòng)態(tài)性與可塑性。

然而，治療誘導(dǎo)的細(xì)胞狀態(tài)或表型轉(zhuǎn)換并非是藥物敏感與CSCs樣藥物抵抗、非干性與干性狀態(tài)的簡(jiǎn)單、雙向轉(zhuǎn)換。研究表明，DTPs可有多個(gè)耐受狀態(tài)。如EMT過程中，上皮與間充質(zhì)狀態(tài)之間還存在具有CSCs特性的過渡態(tài)；其向上皮、間充質(zhì)的不同分化程度導(dǎo)致了藥物耐受的不同狀態(tài)[30]。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，黑色素瘤MRD存在對(duì)MAPK抑制劑耐受的多種狀態(tài)：侵襲性或未分化的間充質(zhì)樣黑色素瘤細(xì)胞、黑色素瘤神經(jīng)嵴干細(xì)胞(NCSCs)、高度色素或分化狀態(tài)黑色素瘤細(xì)胞和“饑餓樣”黑色素瘤細(xì)胞。其中，NCSCs是主要的藥物耐受狀態(tài)，其存在與非遺傳適應(yīng)耐藥細(xì)胞的產(chǎn)生一致，此外，未分化間充質(zhì)樣細(xì)胞也可具有耐藥性[12]。以上多種耐受狀態(tài)共存的現(xiàn)象表明，在單細(xì)胞水平腫瘤細(xì)胞存在藥物抗性基因的轉(zhuǎn)錄波動(dòng)即“轉(zhuǎn)錄噪聲”，小部分腫瘤細(xì)胞如CSCs因其抗性基因表達(dá)在治療瞬間超過閾值，被動(dòng)隨機(jī)選擇并短暫存活下來，呈現(xiàn)達(dá)爾文選擇現(xiàn)象[16]。當(dāng)藥物暴露時(shí)間延長(zhǎng)，部分非CSCs細(xì)胞可通過表觀遺傳學(xué)修飾主動(dòng)重編程獲得藥物抵抗?fàn)顟B(tài)，建立含CSCs的DTPs池，這些變化屬“后天慣性”，因而又支持拉馬克誘導(dǎo)學(xué)說。

由此可見，微環(huán)境刺激觸發(fā)、藥物壓力選擇下，自然選擇或/和重編程獲得的耐藥性CSCs可能是不同腫瘤類型DTPs藥物耐受的共有機(jī)制[1,2,16,29]。尤其是，CSCs重編程導(dǎo)致了DTPs的狀態(tài)或表型的可塑性，體現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞對(duì)微環(huán)境刺激與藥物壓力的適應(yīng)性，改變了耐藥細(xì)胞僅由CSCs產(chǎn)生的單一進(jìn)化路徑，提示CSCs重編程對(duì)腫瘤細(xì)胞耐藥性具有重要的意義。因此，靶向化療誘導(dǎo)耐藥性CSCs的重編程機(jī)制可作為未來逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的新途徑。

4 藥物誘導(dǎo)細(xì)胞可塑性的靶向治療啟示

針對(duì)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞可塑性的DTPs藥物耐受機(jī)制，靶向細(xì)胞可塑性可分別從防止、消除和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞狀態(tài)或表型轉(zhuǎn)換入手。在預(yù)防腫瘤細(xì)胞可塑性方面，可采用間歇性給藥方式，以防長(zhǎng)期用藥引起細(xì)胞狀態(tài)或表型轉(zhuǎn)換為永久耐藥的狀態(tài)或表型。例如，Das，等[31]采用間歇性給藥方式，黑色素瘤細(xì)胞對(duì)靶向藥物維美拉非尼的治療反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)了一倍[31]。此外，采用靶向治療與化放療、免疫治療聯(lián)合的策略，抑制癌基因下游重新激活的關(guān)鍵通路如PI3K、YAP等信號(hào)，采用靶向表型轉(zhuǎn)換機(jī)制的策略，如DTPs或慢循環(huán)周期細(xì)胞內(nèi)源性藥物耐受信號(hào)通路、新表型轉(zhuǎn)換的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。

其次，新出現(xiàn)的細(xì)胞狀態(tài)或表型具有對(duì)特定藥物的敏感性，可作為新的治療靶點(diǎn)。如，神經(jīng)-內(nèi)分泌轉(zhuǎn)分化表型轉(zhuǎn)換機(jī)制中，轉(zhuǎn)化的SCLC失去了EGFR的表達(dá)，因而對(duì)EGFR抑制劑不反應(yīng)，但可對(duì)鉑類-依托泊苷有短暫的反應(yīng)，或?qū)ψ仙纪轭愃幬镉休^高反應(yīng)率[9,32]，在藥物誘導(dǎo)的EMT表型轉(zhuǎn)換機(jī)制中，可通過抑制間充質(zhì)樣細(xì)胞生存所依賴的谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase4，GPX4)，靶向殺傷新出現(xiàn)的耐藥間充質(zhì)樣細(xì)胞[9]。

最后，細(xì)胞可塑性主要通過表觀遺傳修飾機(jī)制調(diào)控，因此阻斷表觀遺傳修飾機(jī)制可望恢復(fù)或逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞對(duì)治療藥物的敏感性。表觀遺傳修飾調(diào)控因子如EZH2和REST、細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)錄因子如SOX和BRN2及EMT相關(guān)基因通路，都可作為潛在藥物開發(fā)靶點(diǎn)。

需要注意的是，上述藥物誘導(dǎo)細(xì)胞可塑性的機(jī)制大多數(shù)是在體外細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)的，在應(yīng)用至臨床前首先需要進(jìn)行體內(nèi)模型的觀察和驗(yàn)證。另外，參與細(xì)胞可塑性調(diào)控的表觀遺傳修飾機(jī)制或非遺傳適應(yīng)性機(jī)制同時(shí)也是機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持或損傷修復(fù)等生理病理過程的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，對(duì)其靶向抑制時(shí)需要考慮其潛在的可能毒性和不良反應(yīng)。

5 結(jié)語

腫瘤細(xì)胞非遺傳適應(yīng)性藥物抵抗機(jī)制的提出極大挑戰(zhàn)了基于基因組學(xué)的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)理念，同時(shí)也提示基于基因突變來決策指導(dǎo)癌癥的治療方案可能并非解決腫瘤耐藥性的唯一途徑。因此，基于針對(duì)細(xì)胞可塑性或CSCs重編程的治療策略或?qū)槟孓D(zhuǎn)腫瘤耐藥性帶來新的希望和突破。未來，單細(xì)胞多組學(xué)(基因組、表觀組、轉(zhuǎn)錄組)、空間轉(zhuǎn)錄測(cè)序、單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展，以及體內(nèi)譜系追蹤技術(shù)與功能表型、轉(zhuǎn)錄因子動(dòng)態(tài)分析技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，可為細(xì)胞表型可塑性或CSCs重編程研究提供更多的證據(jù)，更多的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換現(xiàn)象及其動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換過程將被逐漸揭示，也可為靶向治療策略提供更多可借鑒的方案。