噬菌體對口腔疾病發(fā)生發(fā)展和治療的影響及機(jī)制

茍 冊，賈小玥，李雨慶，楊 燃，鄒 靜

病毒是人類口腔微生物群落中的重要組成部分，與口腔健康息息相關(guān)[1]，噬菌體是特異性感染細(xì)菌、真菌等微生物的病毒，由蛋白質(zhì)外殼中包含DNA或RNA基因組成，是最主要的口腔病毒[2]。根據(jù)其生活方式的不同，噬菌體可分為毒性噬菌體(virulent phage)和溫和噬菌體(temperate phage)。毒性噬菌體，又稱為溶菌性噬菌體(lytic phages)，以裂解周期為特點(diǎn)，通過注入并復(fù)制其DNA導(dǎo)致宿主細(xì)胞裂解并釋放其子代噬菌體。溫和噬菌體，又稱為溶原性噬菌體(lysogenic phage)，啟動(dòng)溶原性周期后，這種噬菌體可將其基因組整合到宿主細(xì)胞染色體中或?qū)⑵渚S持為質(zhì)粒，并隨宿主的繁殖不斷生成含有噬菌體的溶原性細(xì)胞。特定情況下溫和噬菌體也可能啟動(dòng)裂解周期[3-4]。

噬菌體是口腔生態(tài)系統(tǒng)中穩(wěn)定并具有特異性組成的部分，在人類口腔生態(tài)系統(tǒng)中具有重要作用[5-6]。噬菌體在口腔中廣泛分布，可與宿主相互作用保持口腔微生態(tài)的相對穩(wěn)定。在牙周炎、齲病等口腔疾病中，相關(guān)噬菌體豐度顯著改變，提示噬菌體與部分口腔疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚[6-7]，因此本文將對噬菌體在人類口腔微生物群落中的分布特點(diǎn)及其對口腔疾病發(fā)生發(fā)展和治療的作用和機(jī)制作一綜述，旨在為相關(guān)口腔疾病的發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供新的思路。

1 噬菌體在口腔微生物群落中的分布特點(diǎn)

在早期研究中，Brady等通過電子顯微鏡觀察到牙菌斑中的病毒樣顆粒(virus-like particles，VLP)，提示口腔微生物群落存在噬菌體的可能性[8-11]。近年來，多項(xiàng)研究通過宏基因組學(xué)測序和重疊譜噬菌體群落(Phage Communities from Contig Spectrum, PHACCS)進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示人類口腔的微生物群落、牙菌斑和咽峽部微生物群落中均勻分布多種噬菌體[12]。噬菌體在口腔不同部位微生物群落中的分布具有特異性，可受氧氣、碳水化合物含量等因素的影響。牙齒的齦上區(qū)域生境中含有較多的碳水化合物和氧氣，噬菌體主要感染需氧菌，而齦下區(qū)域相較于齦上區(qū)域?yàn)闊o氧環(huán)境，噬菌體主要感染兼性厭氧菌[13]。

2 噬菌體與口腔菌群以及宿主的相互作用

口腔中最常見的噬菌體類型為長尾病毒科、肌病毒科和短尾毒科，長尾噬菌體(Siphoviridae)為溶原性病毒[14]。研究表明，溶原性噬菌體介導(dǎo)的移動(dòng)遺傳元件對于口腔內(nèi)抗生素耐藥性的傳播至關(guān)重要[15-16]。肌尾噬菌體(Myoviridae)和短尾噬菌體(Podoviridae)為溶菌性噬菌體，能迅速消除其易感宿主，對細(xì)菌具有更強(qiáng)的毒力，溶菌性噬菌體導(dǎo)致的細(xì)菌死亡占細(xì)菌死亡總數(shù)的20%～80%，因此溶菌性噬菌體在生物群落中的比例增加是極為重要的細(xì)菌限制因素[17]。

口腔噬菌體可以與口腔菌群相互作用，建立噬菌體-細(xì)菌感染網(wǎng)絡(luò)[18]?？谇皇删w通過噬菌體-細(xì)菌感染網(wǎng)絡(luò)抑制或促進(jìn)口腔致病菌的生長，參與口腔微生物群的演替過程。噬菌體-細(xì)菌感染網(wǎng)絡(luò)中的噬菌體分為特異性噬菌體和交叉感染噬菌體兩類。特異性噬菌體(specific phage)是僅侵襲一種細(xì)菌宿主的主要噬菌體類型，其入侵的短片段DNA僅與一類細(xì)菌的CRISPR高度相關(guān)，遵循一對一的感染模型。交叉感染噬菌體(cross-infective phages, CIP)則是與多種細(xì)菌種類有關(guān)的非宿主特異性噬菌體，遵循一對多模型，使細(xì)菌與噬菌體之間的通信復(fù)雜化[18]。

目前，噬菌體對口腔菌群的影響和作用機(jī)制尚不明確。特異性的溶原性噬菌體將自身基因整合至致病菌染色體，產(chǎn)生大量子代溶原性噬菌體及溶菌性噬菌體，裂解細(xì)菌。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌針對噬菌體特有的免疫系統(tǒng)[19-20]，溶原性噬菌體可通過轉(zhuǎn)運(yùn)自身限制/修飾酶等途徑來逃避該系統(tǒng)的同源序列[21-23]，從而使其長期持續(xù)存在于致病菌中[9,24]。特異性的溶菌性噬菌體可通過吸附、穿入特異性致病菌并合成子代噬菌體，進(jìn)而裂解致病菌并釋放大量的細(xì)胞毒素與酶，引起免疫反應(yīng)，造成口腔組織損傷[25]?？谇皇删w與細(xì)菌之間相互作用，形成了復(fù)雜的噬菌體-細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)，繼而通過多種形式影響口腔微生物群的演替過程。

3 噬菌體在口腔疾病發(fā)生發(fā)展中作用

3.1 牙周炎

牙周炎是由牙周致病菌誘導(dǎo)的發(fā)生于牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，可導(dǎo)致牙周組織破壞和患牙松動(dòng)脫落[26-28]。研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者口腔微生物群落中細(xì)菌和病毒的豐度均發(fā)生改變[21,29-30]。有學(xué)者等通過RNA測序分析牙周炎患者及牙周健康受試者的唾液樣本，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)牙周炎患者的溶菌素表達(dá)量顯著高于牙周健康受試者，而溶菌素是噬菌體的高表達(dá)產(chǎn)物，提示牙周炎患者口腔微生物群落中噬菌體豐度增加[1]。李飛等通過提取DNA并采用PCR及特異性引物檢測牙周炎患者及牙周健康受試者的齦下菌斑，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)噬菌體Req-DTP在牙周炎患者中的檢出率遠(yuǎn)高于牙周健康者，證明噬菌體Req-DTP在牙周炎患者牙菌斑中豐度顯著增加[31]。

目前，噬菌體與牙周菌群的相互作用以及對牙周炎發(fā)生發(fā)展的影響和機(jī)制尚不清楚。此外，有研究顯示在牙周病模型中交叉感染噬菌體與牙周病原體之間呈顯著負(fù)相關(guān)，交叉感染噬菌體可感染多種致病菌并抑制病原菌的生長，降低致病菌的豐度，可能參與調(diào)控口腔微生態(tài)平衡[18]。有學(xué)者通過RNA測序牙周炎患者及牙周健康者的唾液、齦上及齦下生物膜樣本，發(fā)現(xiàn)牙周病患者較牙周健康者齦下菌斑內(nèi)的肌尾噬菌體豐度增加，肌尾噬菌體屬于溶菌性噬菌體，提示牙周炎患者牙周微生物群落中噬菌體豐度的改變可能與牙周菌群改變有關(guān)[21]。另有研究顯示，牙周疾病的炎性環(huán)境激發(fā)細(xì)菌的相關(guān)應(yīng)激反應(yīng)，致細(xì)菌對酸性或堿性環(huán)境產(chǎn)生抵抗力，誘導(dǎo)某些溶原性噬菌體進(jìn)入裂解周期，導(dǎo)致細(xì)菌裂解[1,29]。伴放線聚集桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans，Aa)在患有掌跖角化-牙周破壞綜合征兒童的快速毀滅性牙周炎的發(fā)病機(jī)理中起著關(guān)鍵作用，也是局限性青少年牙周炎(localized juvenile periodontitis，LJP)的疑似病原菌[32]。研究發(fā)現(xiàn)，在LJP患者的牙槽骨吸收部位的微生物群落中存在感染伴放線聚集桿菌的噬菌體。該噬菌體具有廣泛的宿主范圍，最終導(dǎo)致其宿主細(xì)菌的裂解，使牙周膜暴露于高濃度的內(nèi)毒素、外毒素和酶中，并且裂解過程產(chǎn)生大量的有絲分裂原，其能夠在牙周膜中產(chǎn)生多克隆免疫反應(yīng)造成牙周組織的快速破壞。這表明噬菌體、聚集桿菌和牙周組織的快速破壞之間存在密切聯(lián)系[25]。

3.2 難治性根尖周炎

難治性根尖周炎(refractory periapical periodontitis)是指根管治療失敗使根尖周感染持續(xù)存在，導(dǎo)致根尖周病變遷延不愈[33]。糞腸球菌是難治性根尖周炎的感染根管中最常見的微生物，通常是單一感染，是難治性根尖周炎的優(yōu)勢致病菌[34-36]。研究表明，有30%～89%的牙齒根管治療后失敗的患者存在糞腸球菌感染[37-38]，其在營養(yǎng)匱乏的情況下可以長期生存，并對牙髓治療過程中常用的氫氧化鈣治療有抵抗力[39]。

研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體可能參與了糞腸球菌介導(dǎo)的難治性根尖周炎病理過程。Stevens等從難治性根尖周炎根管中分離的10株糞腸球菌經(jīng)過絲裂霉素C處理后，有4株產(chǎn)生了誘導(dǎo)性噬菌體。其中3種溶原性糞腸球菌菌株的噬菌體呈長尾噬菌體特征，另1株溶原性糞腸球菌菌株的噬菌體呈肌尾噬菌體的特征[40]。溶原性糞腸球菌菌株的遺傳物質(zhì)由噬菌體的DNA序列片段所整合，每個(gè)糞腸球菌染色體包含多達(dá)7個(gè)整合的缺陷性噬菌體基因組[41]。包括質(zhì)粒在內(nèi)的噬菌體載體的遺傳信息還可以顯著改變其感染細(xì)菌的致病力，位于噬菌體載體上的基因可以編碼充當(dāng)細(xì)菌毒素的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可以改變宿主細(xì)胞抗原性，影響被膜和粘附因子的產(chǎn)生并增強(qiáng)血清抵抗力，從而增加了糞腸球菌的致病性及耐藥性[40,42-43]。

3.3 齲病

齲病(dental caries or tooth decay)是在以細(xì)菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的一種疾病，是人類中最普遍和持久的疾病之一。變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是人類口腔中天然存在的革蘭陽性兼性厭氧球菌，是機(jī)會(huì)性病原體，大量研究證實(shí)為人類齲齒的主要致病菌[44]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的S.mutans噬菌體有M102、M102AD、APCM01、e10和f1[45-46]。

Al-Hebshi等通過16S rRNA測序分析有齲及無齲兒童的齦上菌斑樣本，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)有齲患兒齦上菌斑中S.mutans噬菌體M102含量明顯高于無齲患兒[47]，提示S.mutans噬菌體可能參與了兒童齲病的發(fā)生發(fā)展。此外，有研究發(fā)現(xiàn)噬菌體M102對S.mutans中數(shù)量最多的血清型C具有特異性，往往與其宿主共同被發(fā)現(xiàn)，由此認(rèn)為噬菌體M102可作為S.mutans血清型C的標(biāo)志，亦可通過此種特性考慮其成為齲病潛在的防治措施[46-47]。

4 噬菌體在口腔疾病治療中的應(yīng)用

4.1 牙周炎的治療

噬菌體療法可通過裂解性噬菌體特異性殺滅病原細(xì)菌，以替代抗生素[48]。具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)是一種革蘭陰性厭氧菌，與牙周疾病的發(fā)展和進(jìn)程直接相關(guān)[49]。有學(xué)者在口腔中發(fā)現(xiàn)屬于Siphoviridae家族的噬菌體Fnp02，可高度特異性感染具核梭桿菌亞種，并且噬菌體Fnp02基因組具有高水平的甲基化，對限制性內(nèi)切酶具有高抵抗力，可以保護(hù)其DNA[50]。Fnp02可通過特異性殺滅病原細(xì)菌影響牙周致病菌具核梭桿菌的豐度，有望作為新型生物控制劑，為牙周炎的臨床治療提供新的思路[27]。

4.2 難治性根尖周炎的治療

難治性根尖周炎具有一定的臨床治療難度，與糞腸球菌生物膜的抗感染性以及多種耐藥菌株等因素相關(guān)。Khalifa等[51]通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)糞腸球菌噬菌體EFDG1，屬于肌尾噬菌體，EFDG1在根管感染的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭心芨咝У馗腥竞蜌⑺栏∮魏蜕锬さ募S腸球菌，并且EFDG1不攜帶任何在其他糞腸球菌噬菌體中已發(fā)現(xiàn)的毒力基因，例如毒素或抗生素抗性基因。EFDG1噬菌體療法是目前較為有前景的難治性根尖周炎治療方法，尤其在生物膜和多藥耐藥菌株導(dǎo)致的常規(guī)抗生素治療失敗時(shí)作為輔助治療策略[51]。另有研究通過噬菌體Ef11/FL1C(Δ36)PnisA處理糞腸球菌感染的牙本質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該噬菌體可顯著減少萬古霉素敏感菌株和萬古霉素耐藥的糞腸球菌菌株[37-38]。并且Khalifa等發(fā)現(xiàn)噬菌體EFDG1能非常有效地消除一個(gè)厚100 μm的糞腸球菌生物膜，7 d內(nèi)生物膜減少量為未處理生物膜的5倍，證明噬菌體對生物膜的破壞率較高[52]。

4.3 齲病治療

Dalmasso等分離出S.mutans的高度溶菌性噬菌體APCM01，APCM01可在低至2.5×10-5的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection)下，數(shù)小時(shí)內(nèi)抑制培養(yǎng)基或人工唾液中的S.mutans生長，降低其代謝活性，提示噬菌體APCM01可作為抑制主要致齲菌S.mutans的一種潛在生物療法[45]。徐晶晶等收集重度低齡兒童齲患者牙菌斑標(biāo)本，分離培養(yǎng)出S.mutans和遠(yuǎn)緣鏈球菌(Streptococcussobrinus，S.sobrinu)，用噬菌體離心出的噬菌體裂解酶ClyR對其進(jìn)行殺菌活性測試，發(fā)現(xiàn)ClyR可在細(xì)菌細(xì)胞壁上打孔，從而使細(xì)菌發(fā)生滲透性死亡，證明ClyR對S.mutans和S.sobrinus均有較強(qiáng)的殺菌作用，或許可以作為一種防齲藥物應(yīng)用于臨床[53]。Delisle等分離出噬菌體M102及其編碼的抗菌酶，以漱口水、凝膠、表皮軟膏、牙膏等制劑作為載體，來抑制口腔中細(xì)菌(主要是鏈球菌)的形成，從而達(dá)到齲齒的預(yù)防[54]。

4.4 口腔黏膜病的治療

噬菌體可應(yīng)用于口腔黏膜疾病或創(chuàng)傷的治療。結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)感染所引起的傳染病，其口腔臨床表現(xiàn)主要為結(jié)核性口腔潰瘍。李宏鳴等采用包含對MTBC敏感的噬菌體Actiphage軟膏局部涂抹，用于輔助治療結(jié)核性口腔潰瘍，噬菌體Actiphage的溶菌作用對口腔病變處結(jié)核桿菌的增殖有一定的抑制作用[55]。

角化細(xì)胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)是一種促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖的特異性生長因子。Li等通過抗角化細(xì)胞生長因子抗體篩選出具有高結(jié)合活性的包含KGF片段的噬菌體，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)2種能與人口腔黏膜上皮細(xì)胞(human oral mucosal epithelial cells，HOMEC)的KGF受體相結(jié)合的KGF樣噬菌體模型肽，后者可促進(jìn)體外HOMEC增殖并且無致瘤作用，亦對傷口感染有一定抑制作用，提示KGF樣噬菌體模型肽可作為促進(jìn)口腔黏膜傷口愈合的潛在方法[56]。此外，另有研究通過噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建KGF噬菌體活性肽，后者對口腔癌放療術(shù)后所導(dǎo)致的放射性口炎有一定治療作用[57]。

4.5 其他

噬菌體亦可應(yīng)用于口腔疾病的預(yù)防。持續(xù)使用包含噬菌體(或其酶)的制劑，如漱口水、凝膠、表皮軟膏、牙膏等，可減少口腔疾病相關(guān)病原體數(shù)量、維持口腔微生物穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而減少口腔疾病的發(fā)生[54]。另有研究表明，噬菌體裂解懸浮液加入軟膏、乳膏等制成的固體或半固體制劑均能對口腔機(jī)會(huì)性致病菌有穩(wěn)定的裂解能力[58]。此外，噬菌體可作為潛在的疫苗傳遞載體，通過直接接種表面攜帶有疫苗抗原的噬菌體或?qū)NA疫苗表達(dá)盒整合到噬菌體基因組進(jìn)行傳遞，為通過噬菌體疫苗預(yù)防口腔疾病提供可能性。

此外，噬菌體還可作為研究口腔微生物組的工具。噬菌體具有特異性和安全性，可與組學(xué)技術(shù)結(jié)合使用，分離出目標(biāo)菌種，以研究復(fù)雜的體外混合生物膜模型以及動(dòng)物和人體內(nèi)的復(fù)雜聯(lián)合模型[59]。

5 總結(jié)和展望

噬菌體是人類口腔最主要的病毒類型，健康口腔中有大量噬菌體存在，噬菌體在調(diào)節(jié)口腔微生物群落穩(wěn)態(tài)和口腔疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。近年來，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到噬菌體在現(xiàn)代生物技術(shù)工業(yè)中具有多種潛在應(yīng)用，包括蛋白質(zhì)和DNA疫苗的運(yùn)輸工具、基因治療的載體、抗生素的替代品、病原菌檢測工具或篩選蛋白質(zhì)、肽或抗體文庫的工具。

噬菌體在口腔疾病的預(yù)防和治療中有良好的應(yīng)用前景，與傳統(tǒng)的抗生素治療相比，噬菌體療法具有許多優(yōu)勢：①噬菌體感染具有特異性，其感染范圍從幾個(gè)菌種到一個(gè)以上密切相關(guān)的屬；②噬菌體存在于宿主時(shí)的自我繁殖能力較高，這意味著較少劑量可能足以控制致病菌的感染；③抗生素和噬菌體之間不存在交叉耐藥性，使得噬菌體成為治療抗生素耐藥菌的有前景的解決方案；④噬菌體易分離，其制劑成本較抗生素更低；⑤與抗生素相比噬菌體破壞生物膜的效率更高[6,30,60]。

但噬菌體療法仍需面對很多問題：隨著噬菌體制劑的使用，可能會(huì)導(dǎo)致抗噬菌體細(xì)菌的進(jìn)化發(fā)展；并且噬菌體作為病毒，能導(dǎo)致革蘭陰性菌裂解并釋放大量內(nèi)毒素，對機(jī)體存在毒性；其次大多數(shù)噬菌體具有高度的免疫原性，可促進(jìn)強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致噬菌體被快速清除或者產(chǎn)生過敏反應(yīng)[30]。

口腔中噬菌體是普遍存在的，大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)噬菌體與口腔疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，當(dāng)前研究顯示部分噬菌體對口腔疾病確實(shí)有一定的療效，但事實(shí)上目前只有很少數(shù)的能夠感染并消滅口腔細(xì)菌的對應(yīng)噬菌體被分離[6]。因此，相關(guān)噬菌體的分離及其對口腔疾病的治療尚需進(jìn)一步深入的研究，期待更多的證據(jù)以及更多的研究發(fā)揮其優(yōu)勢、優(yōu)化其弊端，使其廣泛應(yīng)用于人類口腔疾病的預(yù)防和治療中。