淺談植物細(xì)菌診斷技術(shù)

曲彥達(dá) 劉文鈺

（沈陽(yáng)工學(xué)院生命工程學(xué)院 遼寧撫順 113122）

植物病害防治在食品質(zhì)量和生產(chǎn)中具有重要的作用，作物感染病原菌（如細(xì)菌、病毒和真菌）造成的糧食損失是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中長(zhǎng)期存在的問(wèn)題[1]。病原體、動(dòng)物和雜草造成的損害占全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力損失的20%～40%。了解和控制植物病害的基本前提是做好早期檢測(cè)和鑒定病原，防止疾病傳播和食物損失。

目前，投入作物生產(chǎn)的全部預(yù)算限制了病原菌檢測(cè)方法的常規(guī)使用，有學(xué)者提出采用先進(jìn)的病害檢測(cè)方法，最大限度地減少和預(yù)防作物在生長(zhǎng)、收獲和收獲后加工過(guò)程中的病害危害，并最大限度地提高生產(chǎn)力，確保農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[2]。

在植物病蟲害中，重點(diǎn)研究了植物病原菌及相關(guān)診斷技術(shù)。這些類型的病原體對(duì)作物的生產(chǎn)力和產(chǎn)量造成毀滅性的影響。曼斯菲爾德及其同事[3]根據(jù)科學(xué)/經(jīng)濟(jì)重要性，描述了細(xì)菌性植物病原體“TOP10”清單。這項(xiàng)調(diào)查允許建立一個(gè)按順序排列的名單：紫丁香假單胞菌致病菌；青枯菌；根癌農(nóng)桿菌；稻葉枯單胞菌；野油菜黃單胞菌；黃單胞菌；果膠桿菌和萎縮果膠桿菌。這份名單是部分的，因?yàn)闆](méi)有考慮其他重要的病原體，如分枝桿菌和沙氏假單胞菌。

植物病原菌可以在不同的環(huán)境中生存：在植物中作為病原體，在宿主之外作為腐生植物和附生植物。不利的環(huán)境條件可能會(huì)降低細(xì)菌存活率，并危及疾病的發(fā)生和傳播[4]。相反，當(dāng)病情好轉(zhuǎn)時(shí)，可能出現(xiàn)感染周期。降雨、受污染的農(nóng)業(yè)設(shè)備和/或植物材料、昆蟲促進(jìn)了植物細(xì)菌的傳播。由細(xì)菌引起的疾病癥狀包括葉斑病、枯萎病、枯萎病、結(jié)痂病、潰瘍病、腫瘤和根的軟腐病等。

1 細(xì)菌病原檢測(cè)與鑒定

植物癥狀觀察是疾病管理的第一步，采用光學(xué)方法觀察。一系列國(guó)際文件中描述，疾病的檢測(cè)和/或鑒定實(shí)際上是實(shí)施植物檢疫措施的關(guān)鍵步驟。國(guó)際植物檢疫措施標(biāo)準(zhǔn)（ISPM）第27 號(hào)描述了官方診斷受管制有害生物的程序和方法，并提供了可靠診斷的最低要求。

診斷方法可作為檢測(cè)植物基質(zhì)中細(xì)菌的篩選試驗(yàn)和/或鑒定純化細(xì)菌培養(yǎng)物特性的試驗(yàn)。篩選試驗(yàn)直接評(píng)估病原菌在植物基質(zhì)中是否存在，可以利用不同的技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)需要進(jìn)行快速診斷時(shí)，這些分析尤其有用，因?yàn)榇罅糠N子/植物繁殖材料、等待檢疫診斷、商業(yè)貿(mào)易對(duì)象在機(jī)場(chǎng)或港口受阻。當(dāng)篩選試驗(yàn)結(jié)果為陰性時(shí)，可迅速移取材料，反之，陽(yáng)性結(jié)果則需在純培養(yǎng)基上進(jìn)行分離和鑒定試驗(yàn)，以確認(rèn)結(jié)果[5]。

目前，基于顯微鏡、血清學(xué)、生物化學(xué)、生理學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、分子工具和培養(yǎng)繁殖等不同原理的一些技術(shù)被用作診斷工具。

血清學(xué)提供了細(xì)菌性疾病的間接證據(jù)，而基于廣譜聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)的應(yīng)用，允許對(duì)細(xì)菌進(jìn)行特異性檢測(cè)和鑒定。事實(shí)上，分離和培養(yǎng)繁殖仍然是“黃金”方法，也是準(zhǔn)確診斷的關(guān)鍵步驟[6]。

分離為研究新出現(xiàn)的細(xì)菌性疾病提供了一些不可替代的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榉蛛x可以補(bǔ)充致病性分析，但也可以發(fā)展抗原研究、抗生素或替代化合物測(cè)試、敏感性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、遺傳研究和分類研究。在細(xì)菌診斷中，致病性試驗(yàn)和生物測(cè)定是最后確認(rèn)的必要條件，特別是在出現(xiàn)新的癥狀時(shí)，或在診斷檢疫細(xì)菌時(shí)。此外，分離允許建立用于維持細(xì)菌菌株的培養(yǎng)物集合。

利用以下方法分離細(xì)菌性植物病原菌：（1）選擇性培養(yǎng)基，以阻止或延遲非靶向腐生菌或污染細(xì)菌的生長(zhǎng)；（2）添加了特定基質(zhì)的培養(yǎng)基，該基質(zhì)只能被目標(biāo)細(xì)菌降解，該培養(yǎng)基能夠賦予生長(zhǎng)菌落特定顏色[7]。

細(xì)菌鑒定階段包括基于不同生物學(xué)原理的至少兩項(xiàng)試驗(yàn)（如生化、血清學(xué)和/或分子試驗(yàn)的組合）或基于病原體基因組中不同DNA 序列靶點(diǎn)的兩項(xiàng)分子試驗(yàn)。事實(shí)上，對(duì)一種可疑的植物細(xì)菌病原體的最終鑒定通常需要通過(guò)適當(dāng)接種宿主植物進(jìn)行致病性試驗(yàn)。超敏反應(yīng)試驗(yàn)（HR）對(duì)某些病原菌（如植物病原假單胞菌和淀粉性歐文氏菌）是有用的，但對(duì)其他細(xì)菌種類則幾乎沒(méi)有反應(yīng)[8]。

然而，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有一些缺點(diǎn)，如細(xì)菌培養(yǎng)通常需要數(shù)天或數(shù)周的時(shí)間，這在需要快速、高通量檢測(cè)的情況下是至關(guān)重要的。如果有必要區(qū)分密切相關(guān)的有機(jī)體（低特異性），可能很難根據(jù)單一的整體形態(tài)特征來(lái)區(qū)分細(xì)菌物種。如果植物材料中存在低負(fù)荷（低敏感性），則這些方法不允許檢測(cè)病原體。不同的論文討論了診斷技術(shù)的積極和消極方面，以及免疫和核酸技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)診斷方法具有的優(yōu)勢(shì)[9]。

2 分子方法

分子測(cè)試可以基于雜交或擴(kuò)增技術(shù)，并且可以是高度特異的。大多數(shù)細(xì)菌病原體檢測(cè)方法檢測(cè)DNA，DNA 比RNA 更容易制備，也更穩(wěn)定。

雜交技術(shù)利用探針作為單鏈DNA 或RNA 分子，用放射性同位素、酶或熒光染料等報(bào)告分子標(biāo)記。探針識(shí)別目標(biāo)樣本上的互補(bǔ)DNA/RNA序列，然后檢測(cè)信號(hào)。根據(jù)報(bào)告分子的類型，檢測(cè)步驟可能使用放射性或光（化學(xué)發(fā)光）。探針可以從雙鏈基因組、克隆或PCR 衍生的DNA 中產(chǎn)生。

近年來(lái)，分子診斷方法采用的PCR 技術(shù)比雜交技術(shù)更為靈敏、簡(jiǎn)便、快速。也是在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最多的檢測(cè)技術(shù)。然而，與單用PCR 相比，在基于PCR 的技術(shù)中集成探針可產(chǎn)生更敏感、更特異或更簡(jiǎn)單的診斷方案。第一，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室PCR 檢測(cè)需要在反應(yīng)后取出反應(yīng)液，通過(guò)電泳后在紫外燈下觀察結(jié)果，這就避免不了污染的問(wèn)題，導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生假陽(yáng)性，對(duì)文章下結(jié)論會(huì)產(chǎn)生一定的影響。而探針?lè)ㄔ谌忾]的條件下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和產(chǎn)物分析，這就大大避免了污染的可能性。第二，PCR 擴(kuò)增經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體，從而影響對(duì)條帶的判斷，探針?lè)ㄍㄟ^(guò)特異性的探針雜交信號(hào)檢測(cè)產(chǎn)物，提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

3 圖像光譜技術(shù)

光譜和成像技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用為植物病害的自動(dòng)無(wú)損檢測(cè)提供了可能性。其中，熒光、多光譜或高光譜成像、紅外光譜、熒光光譜、可見(jiàn)/多波段光譜和核磁共振（NMR）光譜是用于植物病害檢測(cè)的植物細(xì)菌檢測(cè)方法。在植物細(xì)菌病害中，熒光光譜法被用來(lái)檢測(cè)柑橘潰瘍病引起的機(jī)械損傷。熒光參數(shù)的變化提供了病原體感染的指示?？梢?jiàn)光譜和紅外光譜已被用作快速、無(wú)損、經(jīng)濟(jì)的植物病害檢測(cè)。高光譜成像技術(shù)在精密農(nóng)業(yè)和脅迫檢測(cè)中的應(yīng)用正獲得越來(lái)越多的發(fā)展，不同的植物病原菌也報(bào)告了高光譜成像通過(guò)測(cè)量感染時(shí)生物物理和生化特性變化引起的反射變化[10]。高光譜圖像集樣品的圖像信息與光譜信息于一身，由于光譜信息能充分反映樣品內(nèi)部的物理結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分，內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異可以通過(guò)特定波長(zhǎng)的光譜值來(lái)表現(xiàn)。在每個(gè)特定波長(zhǎng)下，xy平面內(nèi)每個(gè)像素點(diǎn)的灰度值又與其在該波長(zhǎng)下的光譜值之間一一對(duì)應(yīng)。圖像信息可以反映樣品的形狀、缺陷等外部特征，由于不同成分對(duì)光譜吸收有不同的影響，在某個(gè)特定波長(zhǎng)下圖像對(duì)某個(gè)缺陷會(huì)有較顯著反映，這些特點(diǎn)決定了高光譜圖像技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品內(nèi)外部品質(zhì)的檢測(cè)方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。許多研究人員利用分子方法配合光譜技術(shù)去驗(yàn)證植物疾病的病原。

4 總結(jié)與展望

近年來(lái)，在植物病原檢測(cè)方面的一些研究使得新的開(kāi)發(fā)方法能夠在更短的時(shí)間內(nèi)獲得結(jié)果，如免疫試紙等，有時(shí)比傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)具有更高的性能。然而，這些新方法需要驗(yàn)證。通過(guò)早期發(fā)現(xiàn)來(lái)預(yù)防疾病的發(fā)展和傳播，是正確管理和控制疾病的一個(gè)有價(jià)值的策略。植物病害的檢測(cè)，應(yīng)通過(guò)在野外開(kāi)發(fā)新型傳感器系統(tǒng)，在早期快速、準(zhǔn)確、可靠地進(jìn)行。通過(guò)對(duì)受感染植物的早期診斷，可以避免疾病的傳播。無(wú)癥狀植物可以成為病原菌的貯存庫(kù)，發(fā)展具有提高敏感性、特異性的診斷方法，有助于植物病原菌的鑒定，即使在沒(méi)有疾病癥狀或明顯病原菌跡象的情況下。目前疾病診斷的突破在于光譜、成像技術(shù)和以揮發(fā)性有機(jī)代謝物作為生物標(biāo)記物，隨著技術(shù)不斷發(fā)展，可以期待在植物細(xì)菌檢測(cè)領(lǐng)域的新投入診斷。新技術(shù)需要具備非侵入性和適用性。農(nóng)民的興趣在于解決植物病害引起的問(wèn)題，以快速、實(shí)時(shí)、無(wú)損的方法查明病害的感染情況，以便及時(shí)采取干預(yù)和預(yù)防措施，遏制感染，減少作物損失。

在不久的將來(lái)，開(kāi)發(fā)、測(cè)試和完善可用于原位檢測(cè)植物病害的準(zhǔn)確診斷方法，專為田間使用而設(shè)計(jì)新的植物病鑒定技術(shù)。但是，以可移動(dòng)生物傳感器的形式進(jìn)行采樣和使用該技術(shù)可能在邏輯上具有挑戰(zhàn)性。由于植物葉片具有龐大而復(fù)雜的基因組，可能難以獲得現(xiàn)場(chǎng)DNA 測(cè)序的專業(yè)知識(shí)。對(duì)于數(shù)據(jù)挖掘和分析，高通量計(jì)算生物學(xué)和信息學(xué)將至關(guān)重要。目前，沒(méi)有采取任何措施來(lái)改善可有效鑒定細(xì)菌植物病原體的可運(yùn)輸DNA 測(cè)序生物傳感器。使用遙感設(shè)備進(jìn)行測(cè)序?qū)⒂兄谧R(shí)別多種細(xì)菌植物病原體，這是生物傳感器在植物病診斷中的一個(gè)重要研發(fā)方向。開(kāi)發(fā)小型、經(jīng)濟(jì)、高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單的儀器，使未經(jīng)培訓(xùn)的人員也可以在現(xiàn)場(chǎng)輕松地使用儀器去檢測(cè)細(xì)菌植物病成為現(xiàn)今的主流需求。