丁香水提物的抑菌效應(yīng)及對(duì)兔標(biāo)本保存效果的研究

祖文軒,侯文瀚，王銀燕,林 娜，桂 航，張倩楠，陳士文

在解剖教學(xué)及各類動(dòng)植物標(biāo)本保存的過程中，保存液浸泡保存是最經(jīng)濟(jì)、便攜的處理方式。而目前廣泛應(yīng)用的保存液成分主要是甲醛、乙醇、醋酸等化學(xué)試劑[1-2]。但這類保存液易揮發(fā)，伴有刺激性氣味，長(zhǎng)期使用甚至?xí)p傷操作人員的呼吸系統(tǒng)及血液系統(tǒng)[3]。新型環(huán)保試劑已經(jīng)成為業(yè)界研究的熱點(diǎn)，研發(fā)一種兼顧組織保存和無毒無刺激氣味的保存液對(duì)本學(xué)科的發(fā)展有著重要的貢獻(xiàn)及意義。辛香料在食品保存產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用十分廣泛，其中不乏一些具有防腐抗菌作用的品種。然而，辛香料作為主要成分的保存液研發(fā)及應(yīng)用仍不多見，本研究選取丁香作為實(shí)驗(yàn)辛香料，與傳統(tǒng)甲醛保存液相比較，探究其提取液的抑菌和保存時(shí)間，為辛香料為主要成分保存液的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與分組 將保存液分為陰性對(duì)照組(蒸餾水)，實(shí)驗(yàn)組(丁香水提原液)，陽(yáng)性對(duì)照組(10%甲醛)。實(shí)驗(yàn)組丁香藥材購(gòu)于蚌埠市豐原大藥房中草藥專柜，蒸餾水及10%甲醛由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心解剖教研室實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 水提法制備丁香水提物 稱取10 g丁香放入三角燒瓶,加入100 mL蒸餾水，靜置2.5 h。用組裝好的蒸餾儀器80 ℃下蒸餾提取6 h[4]，將蒸餾完畢的提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)：將提取液放入旋轉(zhuǎn)燒瓶?jī)?nèi)，調(diào)整旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀轉(zhuǎn)速為50 r/min，將提取液蒸發(fā)至10 mL，濃度為1 g/mL，裝入試管內(nèi)保存待用。

1.3 體外抑菌實(shí)驗(yàn) 采用金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌兩種常見細(xì)菌，均由蚌埠醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。分別取100 μL菌液加入0.9%氯化鈉溶液，用麥?zhǔn)媳葷岱ù_定兩種菌的濃度，將菌液濃度調(diào)整為1.0×107CFU/mL，于瓊脂板涂布。取打孔器將濾紙裁剪成直徑6 mm的圓形濾紙片，蒸汽滅菌烘干。將無菌濾紙片浸泡于3組保存液中，1 h后取出晾干。將含菌瓊脂板等面劃分3個(gè)區(qū)域，再將各組濾紙片分別等距貼放于區(qū)域內(nèi)，標(biāo)記，每組重復(fù)3次。將瓊脂板放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)量各組抑菌圈直徑。

1.4 最小抑菌濃度測(cè)定 采用雙倍稀釋法。(1)細(xì)菌懸液的備制：將2種細(xì)菌接種于冷涼肉湯培養(yǎng)基中，放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，使生長(zhǎng)濁度達(dá)到9.0×108CFU/mL。(2)丁香水提抑菌液的稀釋：取26支無菌試管，標(biāo)記編號(hào)，分成2組，每組13支。將菌液作1∶10 000倍稀釋，第一號(hào)試管中加入稀釋后菌液1.0 mL，余下12支試管加入1.0 mL。于第1號(hào)試管中加入1 g/mL丁香水提抑菌液1.0 mL，混合后吸出1 mL加入第2號(hào)試管，以此類推直至第12號(hào)試管，棄去12號(hào)試管中1 mL混合液，此時(shí)每只試管中液體量相同，第13號(hào)管為對(duì)照管。(3)將2組試管放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h后送檢，無細(xì)菌生長(zhǎng)管次中最高藥物稀釋度為最小抑菌濃度。

1.5 保存效果的對(duì)比試驗(yàn) 取新鮮新西蘭兔標(biāo)本，備皮，于深筋膜淺層完整剝離皮膚及皮下組織。用組織剪備制成1 cm×1 cm 大小組織方塊。分別取3組液體20 mL，將組織方塊完全浸泡于液體后，封管，每組重復(fù)6次。比較3組保存液液體顏色，并取樣送細(xì)菌培養(yǎng)，檢測(cè)有無細(xì)菌生長(zhǎng)。

2 結(jié)果

2.1 體外抑菌實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組及陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)革蘭氏陽(yáng)性金黃色葡萄球菌及革蘭氏陰性大腸埃希菌均有抑菌作用，其中丁香水提物對(duì)2種細(xì)菌的抑菌圈直徑分別為(8.67±0.58)mm和(10.27 ±0.83)mm(見表1)。

表1 3組保存液的抑菌圈直徑

2.2 丁香水提液的最小抑菌濃度 記錄2組菌落培養(yǎng)液中細(xì)菌生長(zhǎng)的最大藥物稀釋倍數(shù)，即最小藥物濃度，并計(jì)算丁香水提液的最小抑菌濃度，金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌的最小抑菌濃度分別125 mg/mL和62.5 mg/mL(見表2)。

表2 丁香水提液的最小抑菌濃度測(cè)定

2.3 保存效果的比較 每周觀察并取樣一次，陰性對(duì)照組于第1周即被檢出細(xì)菌產(chǎn)生，且兔皮膚組織軟化，潰爛，試管內(nèi)液體出現(xiàn)渾濁，伴有氣味。陽(yáng)性對(duì)照組無細(xì)菌檢出，兔皮膚組織硬化，彈性差，試管內(nèi)液體呈透明狀，無沉淀及霉菌孢子，保存液刺激性強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)組于第12周開始陸續(xù)檢出細(xì)菌，6組重復(fù)試驗(yàn)中最長(zhǎng)無細(xì)菌檢出時(shí)間可達(dá)15周，最短為12周。該段時(shí)間內(nèi)，兔皮膚組織彈性較陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組佳，無明顯刺激性及異味，隨著細(xì)菌的檢出，試管內(nèi)液體逐漸渾濁，出現(xiàn)腐敗氣味(見圖1)。

3 討論

甲醛在室溫時(shí)易揮發(fā),并且隨著溫度的上升會(huì)加快揮發(fā)速度，產(chǎn)生很強(qiáng)的刺激性氣味，對(duì)人體皮膚和黏膜刺激性大，眼結(jié)膜和呼吸道的刺激尤為強(qiáng)烈，在我國(guó)有毒化學(xué)品優(yōu)先控制名單上甲醛高居第二位，并且已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織確定為致癌和致畸形物質(zhì)[5]，危害人體健康。因此,探求無刺激性保存液取代甲醛液,長(zhǎng)期以來為解剖學(xué)界所普遍關(guān)注，并提出了很多改良方法。例如異噻唑啉酮類混合防腐液、苯甲酸乙醇保存液等[6],但效果并不滿意，存在標(biāo)本質(zhì)地硬、易撕裂，液體易霉變、渾濁，消耗量大等問題。低溫保存技術(shù)可以較好保存人體標(biāo)本，但使用技術(shù)要求高，標(biāo)本反復(fù)升降溫會(huì)滋生細(xì)菌，且成本高昂[7]。生物塑化技術(shù)自二十世紀(jì)80年代發(fā)明以來，在人體解剖學(xué)標(biāo)本制作中得到廣泛應(yīng)用，雖然其固定效果好，但固定后的標(biāo)本理化性質(zhì)完全改變，僅適用于標(biāo)本陳列，并不適合實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科學(xué)研究。國(guó)內(nèi)關(guān)于離子保存液研究較少，且制作難度大，使用成本高[8]。近些年來，隨著化學(xué)技術(shù)發(fā)展，將新型防腐組分引入人體標(biāo)本保存技術(shù)已成為可能[1,9]。利用新型防腐組分用于人體標(biāo)本保存，對(duì)于提高人體標(biāo)本保存效果方面具有較樂觀的前景。

辛香料作為防腐制品最早可以追溯到原始時(shí)代，當(dāng)時(shí)人們發(fā)現(xiàn)剩余的食物如果和一些植物的莖葉一起儲(chǔ)藏，可以抑制食品的腐敗，遮蓋異味。而我國(guó)辛香料作為防腐增味劑在食品加工儲(chǔ)藏運(yùn)輸中已經(jīng)廣泛應(yīng)用[3,10]。本課題組在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中篩選了26種辛香料材，采用水提法得到提取液，初次實(shí)驗(yàn)觀察到丁香有較好的防霉作用，在本研究中進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。

植物的提純方法包括水提法、鹽提法、醇提法和堿提法[11]等。本實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)提取物的抑菌作用，為了排除溶劑本身對(duì)細(xì)菌的抑制作用，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏移，本實(shí)驗(yàn)采用水提法提取丁香活性液。丁香屬木樨科植物，含紫丁香醇、苯乙醇、芳樟醇、大茴香醛等，在我國(guó)華北、東北、西北、華東等地區(qū)有著廣泛的種植與栽培，購(gòu)置成本低，提取物無明顯的刺激性氣味。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丁香水提物對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌的抑菌圈大小相較于10%甲醛無明顯差異。且在12周內(nèi)對(duì)兔皮膚組織有著較好的保存作用。

綜上，丁香水提物具有一定的抑菌作用，在一定時(shí)間內(nèi)有較好的組織保存作用，為新型環(huán)保保存液的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但其有效抑菌成分的純化及長(zhǎng)效保存能力的保證仍需進(jìn)一步的探索。