楊鎮(zhèn)州，李妍，楊雪，劉剛，梁文

上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院化學(xué)與電離輻射所生物計(jì)量實(shí)驗(yàn)室，上海201203

PCR作為分子生物學(xué)的核心技術(shù)，已逐漸發(fā)展為最普遍的核酸定性及定量的研究手段，廣泛用于研究生物體基因表達(dá)水平、生長(zhǎng)發(fā)育、疾病控制等領(lǐng)域[1?6]。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription,RT-PCR）是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增相結(jié)合的技術(shù)[7?9]。由于兩個(gè)反應(yīng)之間無(wú)需額外的開(kāi)蓋和緩沖液更換操作，實(shí)現(xiàn)了核糖核酸的一步法檢測(cè)，具有可降低污染風(fēng)險(xiǎn)、提高檢測(cè)速度、節(jié)省耗材、適用于高通量測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步推動(dòng)了PCR技術(shù)基礎(chǔ)的革新。

2019年，新型冠狀病毒肺炎（coronavius disease 2019，COVID-19)疫情爆發(fā)后，我國(guó)衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的“新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案”[10]、美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心發(fā)布的“實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)2019新型冠狀病毒”使用說(shuō)明[11]、歐盟疾病控制與預(yù)防中心發(fā)布的“新型冠狀病毒檢測(cè)方法和目標(biāo)”12]等，均以RTPCR檢測(cè)陽(yáng)性作為確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”。截至2020年11月3日，獲國(guó)家藥監(jiān)局應(yīng)急審批通過(guò)的新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒主要為RT-qPCR檢測(cè)試劑盒。但是在實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)于確診患者的核酸檢測(cè)，仍然出現(xiàn)了假陰性的問(wèn)題，該結(jié)果一定程度上與核酸檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量有關(guān)。在生產(chǎn)和保存環(huán)節(jié)中，酶易受保存溫度、抑制劑等影響，因此，酶的質(zhì)量是影響試劑盒性能的主要原因。

在RT-PCR反應(yīng)過(guò)程中，涉及兩種作用的酶，即逆轉(zhuǎn)錄作用的逆轉(zhuǎn)錄酶和聚合形成雙鏈DNA的DNA聚合酶，如圖1所示。本研究針對(duì)新冠病毒檢測(cè)試劑盒中逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶兩種酶的作用進(jìn)行研究，以新型冠狀病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板，采用相同的引物探針,考察不同新冠核酸檢測(cè)試劑盒或原料酶的逆轉(zhuǎn)錄酶性能和PCR反應(yīng)中的DNA聚合酶性能、熱穩(wěn)定性能等，最終形成客觀有效的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒中酶的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，旨在為核酸試劑盒的檢測(cè)準(zhǔn)確性提供質(zhì)量控制支撐。

圖1 RT-PCR反應(yīng)原理及考察方法Fig.1 RT-PCR reaction principle and investigation methods

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

新型冠狀病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[GBW（E）091111，GBW（E）091112，上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院]；A:新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒(AgPath-IDTM一步法RT-PCR預(yù)混液，Thermo Fisher)；B:One Step PrimeScriptTMIII RT-qPCR Mix(Takara)；C:一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒(生工生物工程（上海）股份有限公司)；D:TOROIVD Probe 1-step RT-qPCR 5G Premix(Toroivd)；E:新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）雙重核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法，武漢生之源生物科技股份有限公司)；F:新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法，之江生物）；DNA聚合酶（TOROIVD 5G qPCR Premix）；實(shí)時(shí)熒光PCR儀（QuantStudio12KFlex，ThermoFisher）。引物探針序列由上海百力格生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 引物探針序列

針對(duì)SARS-CoV-2的核殼蛋白（nucleoprotein，N）基因，選用我國(guó)疾病控制與預(yù)防中心推薦使用的引物及熒光探針序列（表1）。

表1 N基因的引物探針序列Table 1 The sequences of primers and probe of the N gene

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試劑盒中酶的逆轉(zhuǎn)錄性能考察以相同的新型冠狀病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為檢測(cè)靶標(biāo)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，其中逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程采用不同的逆轉(zhuǎn)錄酶，不同的逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生不同濃度的cDNA。使用相同的DNA聚合酶（TOROIVD 5G qPCR Premix）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，計(jì)算Ct值。將擴(kuò)增后的Ct值代入以一個(gè)數(shù)字PCR準(zhǔn)確定量的cDNA梯度稀釋建立的qPCR工作曲線，得到不同逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA的濃度，分析cDNA產(chǎn)物與目標(biāo)RNA濃度的比值，從而比較逆轉(zhuǎn)錄效率。

1.3.2 試劑盒中酶的PCR性能考察使用1.3.1

中最優(yōu)的逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄得到相同cDNA，進(jìn)行10倍系列梯度稀釋后（以降低緩沖液對(duì)下一步PCR酶的影響），使用6種不同新冠病毒檢測(cè)試劑盒中的DNA聚合酶進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，計(jì)算Ct值并繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并比較PCR擴(kuò)增效率。

1.3.3 試劑盒的RT-PCR性能考察使用6種不同試劑盒中的酶和緩沖液，以10倍梯度稀釋的RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板，進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，計(jì)算Ct值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)試劑盒的RT-PCR性能進(jìn)行比較。

1.3.4 試劑盒中酶的熱穩(wěn)定考察分別將6種不同核酸檢測(cè)試劑盒中的酶放置于37℃條件下1、3、5、7 d后，將低濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（11 copies·μL?1）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄?實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考察不同酶的熱穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒中逆轉(zhuǎn)錄酶的性能評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)以相同的RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為檢測(cè)靶標(biāo)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，其中逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程采用不同的逆轉(zhuǎn)錄酶，不同的逆轉(zhuǎn)錄酶將會(huì)產(chǎn)生不同濃度的cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)cDNA濃度進(jìn)行定量分析，在PCR擴(kuò)增效率相同的情況下，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）含量越高，說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄效率越高，比較逆轉(zhuǎn)錄效率。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線（標(biāo)準(zhǔn)樣品是經(jīng)微滴式數(shù)字PCR定量的DNA）：y=?3.39 lg（x）+32.75。代入6個(gè)不同逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA的Ct值，計(jì)算出6種酶產(chǎn)生的cDNA的濃度，與靶標(biāo)RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度（11 copies·μL?1）相比，得到不同酶的相對(duì)逆轉(zhuǎn)錄效率。如圖2所示，6種酶的相對(duì)逆轉(zhuǎn)錄效率為6.5%~80.7%。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄性能考察實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所有試劑盒中的酶均能對(duì)RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的N基因進(jìn)行有效的逆轉(zhuǎn)錄，但F試劑盒逆轉(zhuǎn)錄效率計(jì)算值最低；F試劑檢測(cè)相同RNA濃度水平下的Ct值均高于其他試劑盒，在逆轉(zhuǎn)錄效率極低的情況下，會(huì)導(dǎo)致Ct值升至太高從而有未檢出的結(jié)果。

圖2 不同酶的逆轉(zhuǎn)錄評(píng)價(jià)Fig.2 Evaluation of reverse transcription of different enzymes

2.2 試劑盒中酶的PCR擴(kuò)增性能評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)使用相同的cDNA樣品，進(jìn)行10倍梯度稀釋，再使用6種新冠核酸檢測(cè)試劑盒中的DNA聚合酶以梯度稀釋的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增效率計(jì)算的經(jīng)典公式如下。

其中k為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率[14]。

如圖3所示，以相同濃度的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，6種酶的線性系數(shù)均超過(guò)0.99，擴(kuò)增效率為90.4%~119.7%，其中試劑盒D擴(kuò)增效率最接近100%，且對(duì)低濃度cDNA擴(kuò)增的Ct值也較小，PCR擴(kuò)增效率相對(duì)最優(yōu)。而試劑盒E擴(kuò)增后的Ct值大，擴(kuò)增能力較差。試劑盒E計(jì)算的擴(kuò)增效率高達(dá)119.7%，分析原因?yàn)槊傅幕钚缘突蛎傅幕钚砸资艿揭种苿┑挠绊?，?dāng)樣品濃度過(guò)高，PCR擴(kuò)增時(shí)DNA模板不能翻倍復(fù)制，導(dǎo)致Ct值增加；當(dāng)濃度逐漸降低時(shí)，酶的活性可使DNA模板翻倍復(fù)制，或者抑制劑的濃度降低對(duì)酶的活性影響變小，因此，低濃度10倍稀釋模板的Ct值差值較小，計(jì)算出的擴(kuò)增效率較高，但其在整個(gè)濃度范圍的DNA聚合酶功能較差。

圖3 不同DNA聚合酶的PCR性能評(píng)價(jià)Fig.3 PCR performance evaluation of different DNA polymerases

2.3 試劑盒2種酶的整體RT-PCR性能評(píng)價(jià)

新冠病毒核酸檢測(cè)試劑盒是將逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶2種功能整合于一個(gè)檢測(cè)體系中，本研究中，使用RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為檢測(cè)目標(biāo)，整體評(píng)價(jià)檢測(cè)試劑盒的RT-PCR性能。使用6種RT-PCR試劑盒中的2種酶，用相同的引物探針，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，根據(jù)擴(kuò)增效率和低濃度擴(kuò)增效果，從整體評(píng)判這6種試劑盒中酶的性能。6種試劑盒的整體逆轉(zhuǎn)錄PCR效率均符合線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2>0.980，擴(kuò)增效率為90%~105%。說(shuō)明所選RT-PCR試劑盒均可以針對(duì)新冠N基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，但整體的逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增效率和R2仍有一定差異。如圖4所示，本實(shí)驗(yàn)所用的6種酶均能對(duì)RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行有效擴(kuò)增。其中試劑盒E和試劑盒F的擴(kuò)增效率較低，與實(shí)驗(yàn)2.1、2.2中結(jié)果一致：F試劑盒的逆轉(zhuǎn)錄效率相對(duì)最低，E試劑盒的PCR擴(kuò)增能力最低。

圖4 不同試劑盒的RT-PCR評(píng)價(jià)Fig.4 RT-PCR evaluation of different enzymes

2.4 酶的熱穩(wěn)定性研究

除了逆轉(zhuǎn)錄效率及PCR效率外，酶本身的保存溫度、熱穩(wěn)定性等性能也會(huì)影響試劑盒的檢測(cè)結(jié)果。本研究選用的酶儲(chǔ)存溫度均為?20℃，有效期均大于6個(gè)月。然而考慮到試劑盒運(yùn)輸過(guò)程中的實(shí)際溫度可能大于20℃，本實(shí)驗(yàn)采用熱穩(wěn)定加速實(shí)驗(yàn)，將試劑置于37℃恒溫條件進(jìn)行考察。如圖5所示，不同酶的37℃熱穩(wěn)定性不同。低濃度的RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行RT-PCR后測(cè)得的Ct值隨著天數(shù)的增加而增大，表明在37℃恒溫條件下，6種酶的活性均下降，其中C、D試劑盒在37℃恒溫條件下放置3 d后，樣品無(wú)法正常擴(kuò)增。A、B、F試劑盒在37℃恒溫條件下放置7 d后，陽(yáng)性樣品能擴(kuò)增，但擴(kuò)增Ct值增大。結(jié)果表明，試劑盒中的酶經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的高溫運(yùn)輸或者由于操作不當(dāng)暴露于較高溫度環(huán)境時(shí)，有可能造成最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陰性等不良后果，因此，需對(duì)酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行控制，并保證試劑盒低溫運(yùn)輸。

圖5 不同酶的熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)Fig.5 Thermal stability evaluations of different RT-PCR enzymes.

3 討論

《2019新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑注冊(cè)技術(shù)審評(píng)要點(diǎn)》中明確指出，制備廠家需提供主要原材料的選擇、來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料，主要原料包括引物、探針、酶、dNTP等。其中最主要的是對(duì)酶活性、功能性等進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證。也有文獻(xiàn)[15]研究表明，核酸檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量問(wèn)題是導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果假陰性的重要原因之一。因此，本實(shí)驗(yàn)采用中國(guó)疾病預(yù)防控制中心推薦的N基因的引物及熒光探針序列，以新型冠狀病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為模板，解決了質(zhì)控這一關(guān)鍵問(wèn)題[15]，從6種核酸檢測(cè)試劑盒中逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄效率、PCR反應(yīng)中的DNA聚合酶性能、整體RT-PCR性能、熱穩(wěn)定性等方面進(jìn)行探討，旨在建立核酸檢測(cè)試劑盒中關(guān)鍵酶的質(zhì)量控制評(píng)價(jià)方法，確保試劑盒核心原料的質(zhì)量，為生產(chǎn)合格的病毒核酸檢測(cè)試劑盒提供技術(shù)保障。

結(jié)合3個(gè)實(shí)驗(yàn)，可得出以下結(jié)論：RT-PCR試劑盒的RT-PCR整體效率，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄效率和PCR效率2個(gè)方面進(jìn)行判斷，三者有顯著相關(guān)性。如A、C試劑盒的整體擴(kuò)增效率，相關(guān)系數(shù)良好，而其逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增的效率和相關(guān)系數(shù)也較理想。而E、F試劑盒的整體擴(kuò)增效率，相關(guān)系數(shù)相對(duì)較差。分別評(píng)價(jià)其逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶活性，發(fā)現(xiàn)F試劑盒逆轉(zhuǎn)錄效率較低，導(dǎo)致其Ct值比其他試劑盒高2~3個(gè)循環(huán)，且PCR酶活性也較低。而試劑E的問(wèn)題主要在DNA聚合酶上，可重點(diǎn)通過(guò)優(yōu)化聚合酶的活性提高整個(gè)反應(yīng)體系的擴(kuò)增性能。

除逆轉(zhuǎn)錄效率及PCR效率外，酶熱穩(wěn)定性也是其重要特性之一。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，低濃度（11 copie·μL?1）RNA標(biāo)物的測(cè)得Ct值升高甚至檢測(cè)不出，說(shuō)明溫度對(duì)RT-PCR的性能影響較大。RT-PCR整體性能相對(duì)較好的A、B試劑盒和相對(duì)不理想的F試劑盒，在熱穩(wěn)定性方面均較佳，這說(shuō)明RT-PCR整體性能與熱穩(wěn)定性無(wú)明顯相關(guān)性，但熱穩(wěn)定性差的酶經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的高溫運(yùn)輸，或者由于操作不當(dāng)暴露于較高溫度環(huán)境時(shí)，可能造成最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陰性等不良后果。

本研究從酶的逆轉(zhuǎn)錄效率、PCR擴(kuò)增效率、熱穩(wěn)定性的性能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和探討，最終得到RT-PCR試劑盒中酶的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，結(jié)果顯示，該方法有助于提高基于RT-PCR原理的核酸檢測(cè)試劑盒質(zhì)量，降低經(jīng)濟(jì)成本和檢測(cè)時(shí)間，有效地保證人民群眾的身體健康和生命安全。